“手十二井穴”放血预处理对大鼠急性低氧肺组织损伤模型血气、HIF-1α及VEGF水平的影响

张义超 洒玉萍 武娟 赵协慧 沈慧萍 刘菲菲 陈发章 吕李飞 马积和

(1青海大学,青海 西宁 810001;2青海省中医院)

氧气(O2)作为机体新陈代谢的主要条件,为人体呼吸系统提供基本的能源支持。急性肺组织损伤(ALI)是由不同致病因素导致的肺组织急性损伤,低氧是导致机体ALI发生的诱因之一。ALI常出现低氧血症性呼吸衰竭和急性呼吸窘迫综合征〔1〕。井穴是特定穴中五腧穴之一,依据中医标本根结学说,井穴放血具有苏窍醒神、泻热通络等作用,可治疗肺、脑等相关疾病〔2〕。在前期研究〔3〕基础上,在西宁地区(2 261 m)海拔下模拟15%O2〔4〕的急性低氧条件,观察井穴放血预处理对大鼠急性低氧肺组织损伤模型血气相关指标氧分压(PaO2)、血氧饱和度(SaO2)、酸碱度(pH)、二氧化碳分压(PaCO2)值和低氧诱导因子(HIF)-1α蛋白表达及血管内皮细胞生长因子(VEGF)含量的影响,为急性低氧环境下应用针灸防治ALI提供实验参考。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 健康成年雄性SD大鼠72只,SPF级,体质量(200±20)g,由西安交通大学医学部实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(陕)2018-001。适应性喂养后,将大鼠按随机数字表法分为对照组8只、急性低氧(模型)组32只、井穴放血预处理(放血)组32只,其中模型组和放血组分成6、24、48、72 h不同时间段4个亚组,每组各8只。本实验过程中动物处理方法严格按照国家科技部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》,符合国际动物伦理法案的要求。

1.2主要实验试剂及仪器 手持式血气分析仪(i-STAT®1,美国雅培),血气生化多项测试卡片(G3+,美国雅培),二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(P0010,碧云天生物工程有限公司),电泳仪(基础型,BIO RAD),低温高速离心机(MIKRO 220R,Hettich),恒温孵育箱(DNP9082,精宏),转移电泳槽(VE 186,上海天能科技有限公司),荧光化学发光成像系统(ChemiQ4600,上海勤翔仪器),酶联免疫吸附测定试剂盒(E-EL-R2603c,伊莱瑞特),全自动常压动物低氧缺氧装置舱(ZKY-4F,杭州艾普),离心机(H1650-W,湖南湘仪),电热恒温培养箱(ICV-450,日本ASONE),多功能酶标仪(Flexstation3,Molecular Devices)。

1.3干预方法 放血组:使用改良后的采血针点刺大鼠双前肢十二井穴进行放血预处理。借鉴人体解剖学的穴位,将比较解剖学用于井穴的选取,将放血组固定于自制鼠板上,先左前肢后右前肢,从“大指”至“小指”,依次按“少商”“商阳”“中冲”“关冲”“少冲”“少泽”的顺序进行针刺,每天1次,每穴出血量以1滴血(约10 μl)为度。模型组与对照组:每日均给予与放血组相同方式抓取1次,但无放血干预。各组按上述干预方式给予相应处理,期间动物自由进水饮食。

1.4模型建立 干预结束后,将模型组和放血组大鼠置于15%O2(15%O2,85%N2)的低氧模拟舱中(参照刘瑞欣等〔4〕造模方法改良)以制备急性低氧肺组织损伤模型〔设置舱内条件:氧浓度(15.0±0.2)%,温度(22±2)℃,湿度50%～60%;舱内放置适量无水氯化钙及钠石灰以吸收二氧化碳及水分〕。大鼠入舱后,舱内氧浓度在15 min内匀速由21%降至(15.0±0.2)%。在舱内暴露相应时间(6、24、48、72 h)后出舱,根据肺组织损伤程度判定模型建立是否成功。

1.5观察指标与检测方法 取材:模型组和放血组于相应时间段(6、24、48、72 h)出舱后,立刻给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,取血结束后,快速剖开胸腔,分离肺组织,于冰台上小心剔除肺外组织,取右侧肺组织置于-80 ℃冰箱保存备用。对照组按上述方法于第8天取材。

1.6手持式血气分析仪方法检测动脉血血气指标 各组腹主动脉采血,使用即刻采出的动脉血0.3 ml,排除空气,弃去前1滴血,将其注入提前平衡至室温的血气生化多项测试卡片血液注样口中,注入的血量至标志处,按压锁盖,将测试卡片放入手持式血气分析仪,输入大鼠编号,2 min后读取血气分析值,记录界面显示的PaO2、SaO2、pH、PaCO2值。

1.7Western印迹法测肺组织HIF-1α表达 从以上样本中各组随机抽取3例冻存于-80 ℃的肺组织,检测HIF-1α含量。按比例加入RIPA裂解液(放射免疫沉淀法裂解缓冲液),充分裂解后,-4 ℃、12 000 r/min离心5 min,取上清。使用BCA法测定蛋白质浓度,计算上样量,上样后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),80 V恒压电泳至分离胶顶端,然后120 V恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底。顺序放置海绵、滤纸、胶、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、滤纸、海绵于转膜夹中,放入转膜槽,200 mA冰上转膜2.5 h。5%脱脂牛奶室温封闭1 h,分别加入稀释好的一抗〔抗HIF-1α、抗磷酸甘油醛脱氧酶(GAPDH)〕、辣根过氧化物酶二抗,加入电化学发光(ECL)液后,将膜放入荧光化学发光成像仪曝光,得到HIF-1α蛋白条带。

1.8ELISA法检测血浆VEGF表达 大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后,腹主动脉采血,3 000 r/min离心15 min后,取上清,严格按照ELISA试剂盒说明书进行后续操作。得到各样本光密度(OD)值后,通过测得的标准曲线计算得到各样本VEGF浓度。

1.9统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析及LSD-t法,方差不齐时采用Welch检验,两两比较选用TamhaneT2检验。

2 结 果

2.1动脉血PaO2值变化 与对照组相比,模型组各时段PaO2均明显下降(P<0.01)。与同时间段模型组相比,放血组有升高趋势,在6、48 h时两组差异有统计学差异(P<0.01),但放血组各时段PaO2值仍明显低于对照组(P<0.05,P<0.01)。见表1。

表1 各组动脉血PaO2、SaO2、pH值、PaCO2及肺组织HIF-1α、血浆VEGF比较

2.2动脉血SaO2值变化 与对照组相比,模型组各时段SaO2值均明显下降(P<0.01)。与同时间段模型组相比,放血组6、24、48 h时SaO2值明显升高(P<0.05,P<0.01);但放血组SaO2仍低于对照组,在6、24 h时有统计学差异(P<0.01)。见表1。

2.3动脉血pH值变化 与对照组比较,模型组各时段pH值有降低趋势,6、72 h时有统计学差异(P<0.01),放血组6 h时pH值显著降低(P<0.01),其余各时段未见明显变化(P>0.05)。见表1。

2.4动脉血PaCO2值变化 与对照组相比,模型组48、72 h时PaCO2明显下降,放血组24、48、72 h时PaCO2明显降低(P<0.05,P<0.01)。与同时间段模型组相比,放血组24、48 h时PaCO2显著下降(P<0.05)。见表1。

2.5各组肺组织HIF-1α蛋白表达 与对照组相比,模型组各时段HIF-1α表达水平显著升高(P<0.01)。与同时间段模型组相比,放血组各时段HIF-1α蛋白表达明显下降(P<0.05,P<0.01),但放血组仍高于对照组,在6、48、72 h时有统计学差异(P<0.01)。见表1、图1。

1～9:对照组、6 h模型、放血组、24 h模型、放血组、48 h模型、放血组、72 h模型、放血组

2.6各组血浆VEGF含量变化 与对照组相比,模型组及放血组各时间段VEGF含量明显升高(P<0.05,P<0.01)。与同时间段模型组相比,放血组各时段VEGF含量下降,在24、48、72 h时有统计学差异(P<0.01)。见表1。

3 讨 论

低氧是高原环境中影响生命活动的主要因素,西宁地区平均海拔已处于2 261 m,依据含氧量属于低氧地区。人体急速进入低氧环境时,器官组织受到不同程度的损伤,肺作为人体通气的门户,是气体交换的场所,肺部内皮细胞的结构最多、毛细血管网数量最大,急性低氧环境损伤肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞,具体损伤程度主要取决于海拔高度和机体对低氧环境的适应。

当前ALI病死率较高,为29%～42%〔5〕,在发生ALI情况下,肺泡-毛细血管壁受到损伤,气血屏障的通透性升高,炎性细胞等渗入肺泡,引起肺泡上皮功能障碍,肺泡液体转运受阻〔6〕,诱导肺水肿的发生,进而肺泡和毛细血管的气体交换减少,造成低氧性呼吸衰竭和急性呼吸窘迫综合征〔7,8〕。此外,ALI发生时,肺血管收缩,肺动脉压力升高,易形成肺动脉高压(PH)。目前国内外报道ALI的病因复杂多样,有研究表明,ALI的发生与急性低氧环境、炎症反应失衡、细胞凋亡、氧化还原失衡、水通道蛋白、凝血与纤溶及遗传基因等密切相关〔9〕。

井穴放血以中医经络学说和气血津液学说为理论基础,经络和气血津液是人体活动的物质基础,也是疾病转归的介质和渠道。放血疗法是独具特色的中医外治疗法,当经络或气血运行不畅时,会影响脏腑正常生理功能,人体络脉的色泽、粗细等表现异常,此时刺络放血能够祛除旧血产生新血,脏腑得新血滋养,功能复常〔10〕。井穴是人体经脉阴阳交汇的场所,可谓小刺激导致大反应〔11〕。手十二井穴在双手指端,拥有丰富的毛细血管网和神经末梢,指端分布量较之于躯干神经纤维有数倍之多,放血刺激强度较大〔12〕;可通过井穴刺激来影响血管内皮细胞的交感神经和局部血管壁上的自主神经,起到调控血管壁张力的作用〔13〕。井穴放血可连通十二经之气,通络祛瘀、激发阳气、改善血运、泻热消肿,在健脑启智、调节机体平衡、改善自主神经等方面具有独特作用〔14〕。另外,对肺脏急性病症有明显疗效〔15〕。

血气能够直接反映肺脏的换气功能和酸碱平衡状态,可用来判断是否缺氧及缺氧程度。本研究结果表明,放血预处理可升高氧分压,进而升高血氧饱和度,对PaO2、SaO2有积极的调节作用,但随着缺氧时间的延长,针刺对其干预效应逐渐减缓,放血对pH值有一定调节作用。井穴放血预处理可在一定程度和时间上升高动脉血中溶解氧气分子量和血红蛋白结合氧含量,对保持酸碱度平衡有一定积极意义,对低氧引起的ALI模型大鼠血气相关指标有积极影响,有利于机体适应急性低氧环境。

HIF-1是介导人体组织、器官与细胞产生缺氧耐受的上游调控因子,参与细胞水平引起的内源性保护机制〔16〕,广泛表达于肺、心、脑等组织器官〔17〕。HIF-1是由α和β亚基组成的异二聚体,氧气不影响HIF-1β表达,而HIF-1α表达受低氧诱导且低氧条件下保持稳定,在常氧环境下将迅速降解〔18〕,它是人体保持氧平衡最重要的氧调节蛋白,细胞中HIF-1α更多介导了急性快速的缺氧过程,且随着时间的增加而被逐步降解,在多种缺血缺氧性及炎性疾病的病程中发挥作用。HIF-1α可以诱导血管收缩物质如内皮素1和一氧化氮合酶等来增多血流,减轻缺血的损伤〔19〕,通过激活与缺氧相关血管生成和线粒体代谢的基因来维持氧稳态,使机体耐受低氧环境。VEGF是HIF-1α的下游调控产物,受低氧诱导VEGF表达增加,VEGF与血管内皮细胞结合,进而增加毛细血管通透性,诱导肺水肿形成。VEGF可促进内皮细胞的扩张、增殖与迁移,新血管生成增多,出现血管狭窄闭塞等肺血管重构现象,增加肺血管通透性诱导ALI大鼠产生肺水肿〔20〕,最终导致低氧性PH(HPH)形成〔21〕。本实验结果表明,随急性低氧时间延长,机体对低氧环境出现了一定的适应,且手十二井穴放血预处理对15%O2急性低氧引起的大鼠肺组织损伤模型的缺氧情况有一定改善作用。

综上,“手十二井穴”放血预处理在一定时间和程度上可改善大鼠15%O2急性低氧肺组织损伤模型的缺氧情况,有利于模型大鼠适应急性低氧环境,其可能的作用与升高动脉血PaO2、SaO2及下调HIF-1α表达、降低VEGF含量有关。本实验手十二井穴放血预处理疗法凸显了《黄帝内经》中关于未病先防的理念,为“病在脏者取之井”(《灵枢·顺气一日分为四时》)理论提供了实验依据,也为针灸临床防治急性低氧肺损伤提供实验参考。