CRNKL1基因rs16981448多态性与中国汉族人缺血性脑卒中及其中医证候显著关联

古联 杨怡冰 苏莉 梁宝云 宋潇宵 罗伟生

(1广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023;2广西中医药大学;3广西医科大学公共卫生学院)

缺血性脑卒中(IS)属于中医范畴内的“中风”,又称之为缺血性中风。2022年美国心脏协会的报告显示,每年约有79 500人发生脑卒中,其中约有61 000人是首发,185 000人是复发〔1〕。它是全球成年人死亡的第二大原因和致残的第三大原因〔2〕。果蝇曲颈基因(CRN)定位于细胞核内,是前mRNA剪接所必需的蛋白编码基因,在细胞周期进程和前mRNA剪接过程中发挥着重要作用〔3〕。转录组学研究表明,曲颈前mRNA剪接因子(CRNKL)1可以抑制细胞mRNA子集的细胞质水平,参与RNA延伸、RNA输出、DNA 修复和细胞周期等过程〔4〕。既往研究发现基因多态性与中医证候的形成相关〔5〕。已有学者探索了基因多态性与急性心肌梗死、高血压等疾病的中医证候的关联性〔6,7〕。但是目前尚未有CRNKL1基因多态性与IS的关联研究报道。本研究旨在探索CRNKL1基因rs16981448多态性与IS及其中医证候的相关性。

1 对象与方法

1.1研究对象 2016～2019年广西中医药大学第一附属医院收治的IS患者为病例组。其中女315例、男459例,平均年龄(64.12±10.34)岁。纳入标准:①符合《各类脑血管疾病诊断要点》中脑卒中的诊断〔8〕,且经过头颅CT和(或)磁共振成像(MRI)确诊;②符合《中风病诊断与疗效评定标准(试行)》中中风病的诊断〔9〕;③符合《中风病辨证诊断标准(试行)》中对各中医证候的诊断〔10〕;④均为中国汉族人群。排除标准:①合并脑出血者;②短暂性脑缺血发作(TIA),因脑血管畸形、动脉瘤、动脉炎、脑外伤等引起的脑卒中;③合并有严重的心、肝、肾等功能不全患者,合并有严重血液系统、免疫系统疾病及梅毒、获得性免疫缺陷综合征等传染性疾病患者。选自同一时期广西中医药大学第一附属医院及社区体检中心的健康体检者设为对照组。其中女356例、男437例,平均年龄(63.81±10.36)岁。纳入标准:均为中国汉族人群。排除标准:①有心脑血管疾病病史;②合并有严重的心、肝、肾等功能不全及免疫系统疾病患者。两组性别分布、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。本研究方案已经通过广西医科大学医学伦理委员会审查,批准编号:20150304-2。所有受试者已签署知情同意书。

1.2基因分型检测 使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集受试者清晨空腹外周血,使用北京艾德莱生物科技有限公司的DNA 提取试剂盒提取外周血液样本DNA,放置在-80 ℃冰箱保存备用。使用 Agena平台的MassARRAY SNP基因分型实验技术对CRNKL1基因rs16981448多态性位点进行基因分型检测,rs16981448多态性位点上游引物:5′-ACGTTGGATGGATGATGTTCTCCTGCTCAC-3′,下游引物5′-ACGTTGGATGAGCCTGACTGCTTTAGTCAC-3′。病例组、对照组的基因分型成功率分别为99.48%(770/774)、99.37%(788/793)。

1.3临床生化指标测定 采用日立7600全自动生化分析仪检测受试者同型半胱氨酸(Hcy)、尿酸(UA)及载脂蛋白(APO)-A、APO-B、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)、胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)。

1.4统计学方法 采用PLINK软件进行遗传关联分析。采用拟合优度χ2检验分析哈温平衡(HWE)遗传定律及组间的基因型频率分布。采用SPSS21.0软件进行χ2检验、t检验或方差分析,Logistic回归分析,一般线性模型分析。

2 结 果

2.1CRNKL1基因rs16981448多态性基因型频率分布比较及HWE检验 CRNKL1基因rs16981448多态性在对照组中的分布符合HWE定律(PHWE=0.335)。rs16981448的小等位基因为G,基因型为GG、GC、CC。rs16981448多态性在病例组与对照组间的基因型频率分布差异具有统计学意义(P=0.039)。血瘀证组、气虚证组与对照组间的基因型频率分布差异具有统计学意义(P=0.014,P=0.030)。见表1。

表1 CRNKL1基因rs16981448多态性在IS不同证候组与对照组基因型频率分布比较(n)

2.2CRNKL1基因rs16981448多态性与IS发生风险的关联分析 CRNKL1基因rs16981448多态性与IS发生风险显著相关〔加性模型:OR(95%CI)= 1.35(1.06～1.72),P=0.016;显性模型:OR(95%CI)为1.40(1.08～1.82),P=0.011;等位基因模型:OR(95%CI)为1.35(1.06～1.72),P=0.015〕,隐性模型与IS发生风险不相关〔OR(95%CI)为1.17(0.42～3.25),P=0.761〕。

2.3CRNKL1基因rs16981448多态性与IS不同中医证候发生风险的关联分析 多因素Logistic回归分析发现,校正年龄、性别后,CRNKL1基因rs16981448多态性与IS痰证(加性模型、显性模型)、血瘀证(加性模型、显性模型)、气虚证(加性模型、显性模型)发生风险的关联均具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。但是,rs16981448多态性与IS风证、火热证发生风险无统计学关联。见表2。

表2 CRNKL1基因rs16981448多态性与IS不同中医证候发生风险的关联分析

2.4CRNKL1基因rs16981448多态性与IS患者UA和Hcy水平的关联分析 CRNKL1基因rs16981448多态性与IS患者的UA(显性模型)、 Hcy(加性模型、显性模型)水平显著相关(P<0.05)。见表3。

表3 CRNKL1基因rs16981448多态性与IS患者UA、Hcy水平的关联分析

2.5CRNKL1基因rs16981448多态性与IS患者血脂水平的关联分析 CRNKL1基因rs16981448多态性与IS患者的VLDL(加性模型、显性模型)、TG(加性模型、显性模型)水平显著相关(P<0.05),但与其他血脂水平的相关性均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 CRNKL1基因rs16981448多态性与IS患者血脂水平的关联分析

3 讨 论

中医诊断的精髓在于整体审查、四诊合参和病症结合。同病异证(治)的思想起源于《素问》:“有病颈痈者,或石治之,或针灸治之,而皆已,其真安在?岐伯曰:此同名异治也。夫痈气之息者,宜以针开除去之;夫气盛血聚者,宜石而泻之。所谓同病异治也〔11〕。”由于机体所处外界环境的不同及个体自身的体质差异,导致不同体质的个体对疾病的易感性不同,最终发展为不同的阶段,即“同病异证”〔12〕。近年来,不少研究将SNP与中医辩证相结合,探讨不同疾病中医证候的易感基因。龙春莉等〔13〕研究发现,Megsin基因C2093T位点CC基因型可能是IgA肾病脾肾气虚证的易感位点,但该位点与IgA肾病风湿热毒证、气阴两虚证、肝肾阴虚证无显著相关性。张宇等〔14〕研究发现,CYP2C19*2基因多态性与IS患者气虚血瘀证具有显著的相关性,但未发现该多态性位点与阴虚风动证、痰热腑实证和风痰瘀阻证有显著相关性。本研究结果说明,基因多态性位点为中医的证候组学提供了分子生物学基础,也为中医“同病异证”提供了理论支持。

有关脑卒中的病因病机,历代医家对其均有不同的认识。唐宋以前医家都持外风学说,认为脑卒中是脏腑失和,营卫不固,外邪侵袭发病。金元时期的朱丹溪主张“痰湿生风”,《丹溪心法》云“半身不遂,大率多痰”,脾胃虚弱,无以运化水谷精微,生湿化痰,痰郁化热生风,上冲于脑〔15〕。李东垣倡导“气虚生风”,脾为后天之本,一为气机升降的枢纽,二来运化水谷精微以濡养机体,老年人脾胃功能虚弱,脏腑经脉失于濡养故而多发〔16〕。此外,气虚无力推动血液在脉管内运行,可导致淤血。痰浊、血瘀、湿滞阻塞脑窍,导致阴阳失调、气血逆乱,发为脑卒中〔17〕。由此可见,痰、气虚、血瘀是导致脑卒中发生的重要病理基础。

CRNKL1位于染色体20p11.23上,在染色体20p11区域存在不少与IS有关的基因。一项全基因组关联研究(GWAS)在IMT染色体20p11的基因间区域检测到两个强相关的SNP(rs16983261、rs6113474),这两个SNPs可能与颈总动脉和颈内动脉的近壁或远壁相关,而颈总动脉和颈内动脉的内膜中层厚度是动脉粥样硬化的既定指标,可预测中风和心肌梗死的风险〔18〕。有报道发现,染色体20p11上的很多基因位点,如ENTPD6 (rs2179638)、PYGB(rs6138553)、GINS1(rs6076347、rs2500406)和RP4-691N24.1(rs16987806、rs6083877)可以导致葡萄糖急性胰岛素反应(AIRg)的变异,AIRg是2型糖尿病的预测因子,而糖尿病是IS发生的危险因素〔19〕。UA是黄嘌呤氧化酶氧化黄嘌呤和次黄嘌呤合成的嘌呤代谢最终产物,可以通过AMP活化蛋白激酶(AMPK)介导的炎症促进动脉粥样硬化的发展〔20〕。新进研究表明,UA不仅能在血清中表达,还能在颈动脉粥样硬化斑块中表达,而颈动脉粥样硬化斑块的破裂容易引发血栓栓塞,这也是IS发生的一个重要原因〔21〕。另有报道〔22〕TMEM63C基因rs3813539位点与IS患者UA 水平显著关联,说明该位点可能参与了IS患者UA的代谢过程,这与本研究的结果类似。早期研究发现,高Hcy是动脉粥样硬化和脑卒中发生的主要危险因素之一〔23〕。高同型半胱氨酸血症可以通过增加不对称二甲基精氨酸(ADMA)的水平导致动脉内皮结构和功能的障碍,使血管壁内产生复杂的变化,还可以诱导氧化应激、内质网应激和未折叠蛋白反应导致动脉粥样硬化血栓的形成〔24,25〕。Huang等〔26〕报道,lncRNA H19 SNP rs217727与IS患者Hcy水平关联具有统计学意义,提示lncRNA H19变异可能影响中国南方汉族人群 IS 患者Hcy的代谢。

血浆中的脂质如TG和TC与冠状动脉疾病(CAD)发生风险相关,TG主要在VLDL、乳糜微粒及其代谢残余物中运输,TC主要在LDL或HDL中携带。与本研究结果相类似的是,既往也有研究报道单核苷酸多态性与IS患者的血脂水平相关。例如,朱殊等〔27〕报道,携带NOS3基因G894T TT基因型的IS患者的LDL-C、TC水平显著高于携带GG和GT基因型患者。另外,Do等〔28〕报道,TRIB1基因rs2954022、APOB基因rs1367117、CILP2基因rs10401969位点与TG、LDL-C及冠状动脉疾病(CAD)发生风险相关,而CAD会增加IS的发生风险。