1株蓝莓灰霉病病原菌的分离鉴定及杀菌剂室内毒力测定

颜倩 侯瑞 李思 罗其鑫 李金子月

摘要：灰霉病是蓝莓生产中的重要病害，近年来严重影响贵州省蓝莓产业发展。为明确蓝莓灰霉病病原菌，采用组织分离法从贵州省麻江县蓝莓基地采集蓝莓灰霉病病叶，分离鉴定蓝莓灰霉病病原菌。通过形态学结构、ITS、HSP60、RPB2多基因序列，系统发育树分析和致病力测定，将分离菌株HM4-1鉴定为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。同时，采用菌丝生长速率测定4种杀菌药剂对菌株HM4-1的室内毒力，结果表明，在相同浓度梯度下4种杀菌剂对病原菌菌株HM4-1菌丝生长的抑制率分别为：啶酰菌胺56.875%～76.563%、异菌脲30.208%～100.000%、百菌清14.667%～43.960%，腐霉利34.250%～100.000%。将4种杀菌剂对该菌株菌丝生长的抑制率进行显著性及室内毒力分析发现，啶酰菌胺的抑制性最佳，EC50为0.622 mg/L，相比于百菌清的相对毒力指数为63.12，异菌脲和腐霉利次之，百菌清较弱，三者EC50分别为1.368、2.488、39.260 mg/L。灰霉病病原菌的分离鉴定和室内毒力测定为进一步研究蓝莓灰霉病综合防控提供了理论基础。

关键词：蓝莓；灰霉病；分离鉴定；室内毒力；抑制率；相对毒力指数

中图分类号：S436.639  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）03-0153-06

笃斯越橘（Vaccinium uliginosum）别称蓝莓，多年生常绿或落叶灌木，属杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium），是营养价值较高的小浆果果树［1］。蓝莓于20世纪开始在我国进行栽培引种，其果实富含花青甙，抗氧化能力强，且低糖、低脂肪对人类健康有益，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一［2-3］。我国引进的品种主要为高丛蓝莓、矮丛蓝莓以及兔眼蓝莓等［4］。近年来随着蓝莓产业迅速的发展，病害也在逐年增加，且危害严重。贵州省常见的蓝莓病害主要为蓝莓灰霉病、蓝莓根腐病、蓝莓枝枯病和蓝莓叶斑病等，对蓝莓的健康生长和产业发展产生极大的危害［5-8］。

灰霉病为植物常见病害之一，其不仅是危害蓝莓的严重病害，也是番茄、草莓和葡萄等植物的真菌性病害，严重影响植物的健康生长［9-11］。蓝莓灰霉病常见病原菌主要为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），目前报道的灰葡萄孢菌主要分为无菌核产孢、产菌核产孢、菌核产孢3种类型，各菌群代表菌株均有致病性，但存在差异［12］。蓝莓灰霉病在多个省份均有不同程度的暴发，严雪瑞等发现我国北方蓝莓主要产区辽宁省、吉林省、山东省等地该病害普遍发生，成为限制蓝莓产业发展的因素之一，我国南方贵州省、浙江省、安徽省的蓝莓灰霉病病害也日益严重［12-13］。贵州作为蓝莓主要产区省份之一，蓝莓灰霉病病害却少见报道，贵州省蓝莓灰霉病高发期为每年3—5月，主要危害蓝莓的花、果、叶和茎秆等部位［14］。其在田间发病症状主要表现为侵染初期叶片、花器等出现病斑，随着侵染时间加长，病斑呈黄褐色水浸状扩散开来，速度快、范围广，直至花器、茎秆发黑腐烂，叶片枯死，且感病植株地下部分会停止生长。

本研究通过对贵州省麻江县蓝莓灰霉病展开病原真菌的分离、鉴定工作，明确其病原真菌种类，同时对蓝莓灰霉病杀菌药剂进行筛选，以期为进一步研究蓝莓灰霉病的防治措施提供相应的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蓝莓灰霉病病样采集自贵州省黔东南州麻江县瑞蓝果业蓝莓种植基地（107°60′73″E，26°52′78″N，海拔为864 m）发病蓝莓植株，供试蓝莓品种为一年生莱格西蓝莓。

培养基：PDA培养基（葡萄糖20 g、马铃薯汁 1 000 mL、琼脂18～20 g）、PDB培养基（葡萄糖 20 g、马铃薯汁1 000 mL）。

供试杀菌剂：50%腐霉利可湿性粉剂（日本住友化学株式会社）、50%异菌脲悬浮剂（苏州富美实植物保护剂有限公司）、75%百菌清可湿性粉剂［先正达（苏州）作物保护有限公司］、50%啶酰菌胺水分散粒剂（山东惠民中联生物科技有限公司）。

1.2 试验时间及地点

于2022年5月在贵州省贵阳市花溪区贵州大学林学院森林病理学实验室开展试验。

1.3 病原菌分离纯化

选取典型发病症状的蓝莓植株利用组织分离法进行病原菌的分离和纯化，得到代表性菌株HM4-1。选取有病斑蓝莓叶片和果实，用水冲洗表面灰层后晾干，将蓝莓病部组织放置超净工作台中，用75%乙醇将病部组织浸泡3 s左右后，放入3%～5%次氯酸钠溶液中浸泡3 min，最后用无菌水冲洗5～8次，将病组织部分剪切为5 mm×5 mm小块，置于无菌滤纸上吸干表面水分，将消毒后的病组织块在PDA平板上轻轻按压后取下，并将该平板作为对照用以检测消毒效果。切取同样大小病组织块接种于PDA培养基中央在25 ℃黑暗条件培养3 d后，用接种针挑取边缘菌丝纯化处理，直到PDA平板上长出形态单一菌落。

1.4 蓝莓灰霉病病原菌的鉴定

1.4.1 形态学鑒定

超净操作台中，内径为5 mm的打孔器先在病原菌菌落边缘打出菌饼，将菌饼接种于PDA培养基中央并放置于25 ℃黑暗条件培养箱中培养3～7 d后，观察菌落的形态、菌丝生长速度、菌丝密度与着生情况等。待菌株培养7～15 d后，采用压片的方法，用光学显微镜对菌株的分生孢子及菌丝形态进行观察［15］。

1.4.2 病原菌致病性测定

根据柯赫氏法则测定病原菌致病性，做有伤接种。纯化好的菌株在PDA培养基中培养3 d后，在菌落边缘取直径为5 mm的菌丝块，将生长状况相同的健康蓝莓叶片用灭菌接种针在蓝莓叶片主脉两侧扎上伤口，并将纯化的菌饼接种到植株伤口上，以无菌PDA 培养基接种到植株作为对照［12］。处理和对照各做10次重复，接种后叶片用双层滤纸和无菌脱脂棉进行保湿处理，置于25 ℃恒温培养箱中，3～5 d后观察叶片发病情况。最后取发病的部位进行病原菌再分离，并将分离后获得的病原菌与接种病原菌进行对比，完成致病性检测。

1.4.3 分子生物学鉴定

以病原菌HM4-1的DNA作为模板，用Fungal DNA Midi Kit真菌DNA提取试剂盒（OMEGA），采用真菌ITS通用引物及基于基因HSP60、RPB2设计的特异引物（表1）进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳纯化后送往重庆擎科兴业生物技术有限公司进行测序。将测得的菌株序列提交到GenBank获得登录号，同时与NCBI数据库序列进行比对，于比对结果中挑取代表性序列在MEGA 7.0中构建菌株系统发育树。

1.5 室内毒力测定

通过观察菌株HM4-1菌丝生长速率检测4种杀菌剂对该菌株的室内毒力。以无菌蒸馏水将杀菌剂原药配制成有效药剂浓度为1×104 mg/L的母液，在配制母液基础上对其进行梯度稀释，4种药剂均按照500、1 000、2 000、5 000、10 000倍浓度稀释［19-20］，稀释液浓度为20、10、5、2、1 mg/L。

将在母液基础上稀释好的药剂放置超浄工作台中，移液枪吸取5 mL药剂于20 mL灭菌处理完冷却至50～60 ℃的PDA培养基中，充分使药剂与PDA混合后倒皿，每种药剂不同浓度制作3个直径为90 mm的含药PDA平板。利用无菌打孔器在活化好的蓝莓灰霉菌株HM4-1边缘打取直径为 5 mm 的菌饼接种于含药平板中央，以无菌水处理为对照，每个处理设置3次重复。置于25 ℃恒温培养箱中暗培养，待对照组菌落基本长满平板后，采用十字交叉法测量各菌落直径，数据采用SPASS 26.0进行显著性分析，并计算各含药平板对蓝莓灰霉菌株HM4-1菌丝生长的抑制率以及各药剂的半最大效应浓度（EC50）、95%置信区间和相关系数（r2）。以药剂抑菌性最弱的EC50为基准值，计算其他药剂的相对毒力指数。

菌丝生长抑制率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-菌饼直径）×100%。

2 结果与分析

2.1 蓝莓灰霉病病原菌的鉴定

2.1.1 病原菌形态学鉴定

从蓝莓叶片中分离出35株形态相似的致病菌，选取代表性病原菌HM4-1进行菌株鉴定、致病性等研究。将菌株HM4-1接种于PDA培养基，于25 ℃恒温培养箱中培养4 d后，菌丝基本长满直径为90 mm的培养皿，发现其生长速度较快，气生菌丝发达，菌丝前期呈白色、地毯式生长（图1-A），后期菌落逐渐从中心由白色转变为灰绿色且开始产生黑色菌核（图1-B）。病原菌在培养10 d时间内开始产孢，以压片的方法于光学显微镜下观察到病原菌HM4-1的产孢结构，孢子整体生长较为密集，聚集于孢子梗周围，孢子梗呈葡萄束状生长，分生孢子无色透明、表面光滑、椭圆至圆形、未见隔膜、单孢生长（图1-C、图1-D），根据其形态特征初步判断病原菌HM4-1为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

2.1.2 蓝莓灰霉病田间症状

田间发病症状为：叶片初期从叶缘呈水浸倒三角状开始侵染形成病斑，花器和果实等感病后也出现病斑、发黑、随发病时间加长，后期出现叶片枯死、花果腐烂，直至整株干枯死亡（图1-E、图1-F）。

2.1.3 病原菌致病性鉴定

蓝莓病组织分离所得到的病原菌HM4-1接种到有伤的蓝莓叶片上，3 d 后叶片可见病斑，3～5 d叶片表面开始出现水浸状病斑，并且扩散快速，且随接种时间延长，叶片表面病斑逐渐蔓延直至枯死（图1-G）。接种HM4-1的蓝莓叶片刺伤处有稀疏的菌丝生长，对比接种无菌PDA琼脂块叶片无发病症状（图1-H）。

2.1.4 病原菌分子学鉴定

将菌株HM4-1的 ITS、HSP60、RPB2序列分别在 NCBI 序列库中进行搜索匹配。比对结果表明，上述序列分别与登录号MT832025.1、MN159921.1、MH732872.1最接近。将基于3个不同引物测序所得病原菌HM4-1序列提交到GenBank，分别获得登录号OP782300、OP830830、OP830831。根据病原菌HM4-1序列相似性分析，采用Phylosuite软件将ITS、HSP60、RPB2序列进行多基因数据串联，在MEGA 7.0中构建菌株HM4-1的系统发育树（图2）。

2.2 4种杀菌药剂对菌株HM4-1菌丝生长的抑制率

通过菌丝生长速率法测定4种杀菌药剂对菌株HM4-1的室内毒力 啶酰菌胺在各浓度下对蓝莓灰葡萄孢菌菌丝生长抑制效果差异不大，与对照菌丝相比抑菌能力较强，处理组各浓度下菌丝生长缓慢，菌丝稀薄，出现明显菌丝营养不足、伸长不够等现象（图3-A）。异菌脲对菌株HM4-1菌丝生长抑制效果尚佳，5～20 mg/L浓度区间对其抑制率大于99%，随着杀菌剂有效含量浓度下降，当浓度为 2 mg/L 时菌株开始生长，有少量稀薄菌丝从平板中央开始向四周生长，当药剂浓度最低（1 mg/L）时，菌丝开始大量正常生长，表明异菌胺对菌株HM4-1的抑制性开始下降，对比对照组菌丝生长情况可知该药剂对菌株还存在一定的抑制效果，但较其他处理浓度来说较弱（图3-B）。百菌清对蓝莓灰葡萄孢菌菌絲的抑制效果在4种杀菌药剂中最差，该处理条件下菌株HM4-1菌丝生长情况尚佳，由对照组情况可知，仍存在一定抑制效果，但随杀菌剂有效浓度降低，对该菌丝生长的抑制性也随之削弱，当浓度为1 mg/L时，抑制率几乎为零（图3-C）。腐霉利对蓝莓灰葡萄孢菌菌丝生长抑制率在浓度为20 mg/L时最佳，菌丝无生长趋势，10 mg/L时次之，菌丝有缓慢生长迹象，其菌丝开始向四周伸长。随浓度降低，其对菌丝生长抑制效果下降，当浓度下降到2、1 mg/L时，腐霉利对菌株HM4-1菌丝生长的抑制差异开始缩小（图3-D）。

在相同浓度梯度下（1、2、5、10 mg/L），4种杀菌药剂对菌株HM4-1菌丝生长均有较好的抑制效果，其中啶酰菌胺和异菌脲效果最佳，对菌株HM4-1菌丝生长抑制率分别为55.529%～76.563%、30.208%～100.000%，腐霉利的抑制效果次之，百菌清对菌株HM4-1的抑制性最弱，仅为14.667%～43.960%（表2）。

2.3 4种杀菌药剂对菌株HM4-1的室内毒力

在相同浓度梯度下4种杀菌药剂对蓝莓灰霉病病原真菌的室内毒力皆处于较高水平，啶酰菌胺、异菌脲、百菌清、腐霉利的EC50分别为0.622、1.368、39.260、2.488 mg/L。其中，啶酰菌胺对菌株HM4-1的室内毒力最高，相对毒力指数为63.12，百菌清和腐霉利对其室内毒力较低，相对毒力指数分别为1.00、15.78（表3）。

3 讨论

本研究通过对贵州省麻江县分离所得到的1株代表性菌株HM4-1结合形态学、多基因序列测序（rDNA-ITS、HSP60和RPB2）分析鉴定，确定蓝莓灰霉病致病菌为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），这与王丹等研究发现的山东省蓝莓灰霉病病原菌rDNA-ITS的鉴定结果［21］一致。 郜海燕等早在2017年利用rDNA-ITS基因序列测序，将浙江杭州蓝莓灰霉病病原菌鉴定为灰葡萄孢菌［22］。本研究同时采用真菌通用测序引物rDNA-ITS 及2种特异引物HSP60和RPB2对蓝莓灰霉病病原菌进行分析鉴定，在贵州省属首次报道。该病原真菌適应性强，寄主范围广，致病率高［23］。

灰葡萄孢菌（B. cinerea）可侵染多种植物进而引发灰霉病，如龙牙百合灰霉病、烟草灰霉病，同时也是草莓和番茄等植物灰霉病的病原菌［9-10，17，24］。灰葡萄孢菌侵染范围较为广泛，可引起世界范围内 1 000 种以上植物发生灰霉病［25］。鉴于其适应性较强的特点，近年来在贵州省各地均有发生，其中麻江、黔东南、遵义地区蓝莓灰霉病发生严重［5］。本研究采用菌丝生长速率法测定4种杀菌药剂（啶酰菌胺、异菌脲、百菌清、腐霉利）对菌株HM4-1的室内毒力［26-27］，结果表明，相同浓度梯度下，4种药剂对菌株HM4-1菌丝生长均有不同程度的抑制作用，其中啶酰菌胺和异菌脲表现出较强的抑制性，室内毒力较高，EC50分别为0.622 mg/L和 1.368 mg/L。李鸿浩等在研究中发现，异菌脲对灰霉病病原菌菌丝生长的抑制作用较强，腐霉利较前两者次之，EC50为2.488 mg/L［28］；张从宇等研究发现，分离所得灰霉菌株中，有56%的菌株对腐霉利产生较强抗药性［29］。百菌清对菌株HM4-1菌丝生长抑制作用较弱，EC50为39.260 mg/L，说明菌株HM4-1对其产生较高抗性，抑制效果较差。设置相同浓度梯度下，啶酰菌胺和百菌清对菌株HM4-1的毒力回归方程相关系数趋近于1，而异菌脲、腐霉利的相关系数则较前两者略低，表明在该浓度梯度下，菌株HM4-1的菌丝在杀菌剂啶酰菌胺和百菌清中生长状态变化较为平缓，而异菌脲及腐霉利对HM4-1菌丝生长变化影响随着浓度不同波动较大，从而导致其相关系数较低。啶酰菌胺在各浓度下对灰霉菌菌株的抑制率差异较小，效果较佳，异菌脲5、10、20 mg/L浓度下对灰霉菌菌株的抑制性最高，腐霉利仅在20 mg/L浓度下对菌株HM4-1菌丝生长

有较强抑制性，菌株HM4-1对百菌清产生抗药性，各浓度下抑制效果差于其他3种杀菌剂。

蓝莓灰霉病对蓝莓产量和品质影响严重，本试验通过对贵州省麻江县蓝莓灰霉病病原真菌的分离鉴定以及不同杀菌药剂对其的室内毒力测定，可为下一步展开深入研究和防治工作奠定基础。

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