基于GEO数据库分析水稻低温胁迫关键基因

阮先乐

摘要：为了筛选水稻在低温胁迫下的关键基因，从GEO数据库下载水稻4个数据集中的70个样本。利用在线分析程序GEO2R进行共同差异表达基因分析，并对这些差异表达基因进行GO、KEGG分析，构建蛋白质互作网络，对关键基因构建热图。结果表明，获得共同差异表达基因51个，其中上调表达基因1个，下调表达基因50个。上述基因的GO分析结果表明，其细胞组成主要集中在细胞、细胞要素和细胞器上；在分子功能上，上述基因的功能主要集中在结合、催化活性上；在生物过程中，上述基因的功能主要集中在细胞过程、代谢过程和生物调控上。KEGG信号通路分析结果表明，上述基因主要参与植物激素信号转导等通路。在构建的共同差异表达基因的蛋白质网络中，有29个节点。另外，得到10个关键基因、2个关键子网络。研究结果为进一步研究水稻低温胁迫关键基因奠定了基础，也有利于水稻低温育种。

关键词：水稻；GEO数据库；低温胁迫；共同差异表达基因；GO功能分析；KEGG信号通路分析

中图分类号：S511.01；S126  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）03-0061-06

水稻（Oryza sativa L.）起源于热带与亚热带，是低温敏感型作物。低温严重影响了水稻的产量和品质，也限制了水稻向高海拔、高纬度地区扩展［1］。从全球范围来看，目前有24个国家约1 500万hm2的水稻受到低温影响，在亚洲南部、东南部，约700万hm2的土地由于受到低温影响而无法种植水稻［2］。在我国的东北地区，由于纬度较高、温度偏低，每3～5年就会发生1次冷害［3］。因此，培育耐冷水稻品种具有十分重要的现实意义。

植物的耐冷性是多基因效应的，其机理复杂，而利用传统育种方式在改良植物耐冷性方面有限制。如果采用基因工程技术进行作物育种，是提高植物耐冷性比较有效的途径［4］。水稻與低温胁迫相关的基因可以分2类：第1类是功能基因，其编码产物在水稻受到低温胁迫时直接起到保护作用；第2类是调控基因表达的信号因子［5］。闫凌月等研究发现，OsMADS25通过提高水稻在低温胁迫下对活性氧的清除能力，进而提高其对低温的耐受性［6］。Hur等研究发现，水稻中合成脯氨酸的关键基因OsP5CS2对提高水稻的耐冷性十分重要［7］。Li等研究发现，OsTPS1基因的超表达能够提高转基因水稻对干旱、盐和低温胁迫的耐受性［8］。陈能刚等研究发现，在孕穗期、开花期，转异戊烯基转移酶基因（isopentenyl transferase ipt）水稻的相对电导率的变化量和叶绿体受低温的危害较小［9］。张明星构建的OsWRKY63水稻突变体具有较强的耐冷性，为水稻耐冷品种的选育提供了潜在基因资源和中间育种材料［10］。Wang等研究发现，含有OsDREB1F基因的转基因水稻对盐、干旱和低温的耐受性有所提高［11］。另有研究也发现，转录因子MYB、SNAC、TCP、PHD、bZIP与水稻的耐冷性有关［12-16］。

GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是一个公共功能基因组数据存储库，目前储存了100多个物种的约十亿个基因表达数据，科研人员借助基于WEB的工具，有效地探索、查询和下载这些海量数据，从而更好地分析和设计自己的试验。本研究采用生物信息学技术分析GEO数据库中与水稻低温胁迫相关的一些数据，筛选关键差异基因及其功能、信号通路，以期研究低温胁迫对水稻生长发育影响的分子机制，从而为今后水稻耐冷性育种奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 基因芯片数据的获取与筛选

水稻低温胁迫基因表达谱芯片数据来源于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GEO数据库。基于对获得的初始数据的分析与试验要求，采用GSE6901、GSE31874、GSE37940和GSE71680共4个数据集，选择其中70个样本进行数据分析（表1）。试验分析时间是2022年10—12月，地点在周口师范学院。

1.2 方法

1.2.1 共同差异表达基因的筛选 首先利用GEO数据库中的在线分析程序GEO2R对不同数据集的处理组、对照组进行分析，并以P<0.05、|log2 FC|≥2作为差异表达基因筛选的标准。然后，利用Evenn（http：//www. ehbio.com/test/venn/#/）获得4个数据集的共同差异表达基因。

1.2.2 共同差异表达基因的GO功能分析和KEGG信号通路分析 首先在UniProt数据库（https：//www.uniprot.org）中查询各个共同差异表达基因的GO号，然后利用WEGO 2.0（https：//wego.genomics.cn/）进行共同差异表达基因的GO功能分析。KEGG信号通路分析利用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）、KOBAS （http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）2个在线网站。

1.2.3 蛋白互作网络的构建 用STRING（https：//cn.string-db.org/）和Cytoscape 3.9.1软件构建共同差异表达基因的蛋白质互作网络关系图，用Cytoscape 3.9.1 Cytohubba插件筛选关键基因，用Cytoscape 3.9.1 MCODE筛选关键子网络。

2 结果与分析

2.1 共同差异表达基因的筛选结果

利用4个数据集的70个样本进行研究分析，按照规定的筛选标准，从GSE6901中获得1 107个基因，从GSE31874中获得2 537个基因，从GSE71680中获得184个基因，从GSE37940中获得498个基因。之后，经Evenn在线分析，获得51个共同差异表达基因 （图1），其中上调表达基因1个，是AK108642，下调表达基因50个（表2）。

2.2 共同差异表达基因的GO功能分析和KEGG信号通路分析

对共同差异表达基因的GO分析结果（图2）表明，细胞组成主要集中在细胞、细胞要素、细胞器上，分别达到41.2%、41.2%、35.3%。在分子功能上，这些基因的功能主要集中在结合、催化活性上，分别达到62.7%、31.4%。在生物过程中，这些基因的功能主要集中在细胞过程、代谢过程、生物调控上，分别达到49.0%、41.2%、39.2%。KEGG信号通路分析结果（表3、图3）表明，这些差异表达基因主要参与植物激素信号转导、植物病原相互作用、类胡萝卜素生物合成、脂肪酸延伸、RNA降解和次生代谢产物的生物合成等通路中。

2.3 共同差异表达基因的蛋白质网络构建与关键基因的筛选

利用STRING数据库与Cytoscape软件对共同差异表达基因构建蛋白质网络，最终得到29个节点 （图4-a）。另外，得到10个关键基因（图4-b）、2个关键子网络（图4-c、图4-d）。这10个关键基因的热图见图5。

3 讨论和结论

本研究基于GPL2025、GPL7344等2个平台上的4个数据集的70个样本进行基因表达数据的分析。最终筛选出共同差异表达基因51个，其中上调表达的基因只有1个，下调表达的基因50个，并用Cytoscape 3.9.1 Cytohubba筛选出10个关键基因。

KEGG信号通路分析结果表明，植物激素信号转导过程是一个主要的信号通路过程。脱落酸（ABA）是植物体内一种多功能植物激素，植物在非生物胁迫下，其体内的ABA含量通常会升高，从而可以增强植物应对干旱、盐、低温等非生物胁迫的能力［17］。一些早期的研究结果表明，内源性ABA的积累是植物对低温胁迫的响应［18-20］，另有研究证实，ABA处理能够增强黄瓜、苜蓿的抗寒性［21-22］。在本研究中，植物激素信號转导路径涉及AK107854、AK120087、AK070649等3个基因，这3个基因都与转录因子TIFY有关。几乎所有的OsTIFY基因对干旱、盐度和低温等有一种或多种非生物胁迫有反应［23］。徐佳宁的研究发现，几乎所有苹果MdUPL基因的表达都受到盐、干旱或者低温胁迫的诱导，尤其是MdUPL7、MdUPL9在低温胁迫下表达量显著上调［24］。Ca2+已经被证明是植物冷胁迫的第二信使，而编码CML的基因参与了冷胁迫诱导的Ca2+信号途径［25］。Hu等研究发现，KCS与小麦的耐冷性有关［26］。YLS9（YELLOW-LEAF-SPECIFIC GENE 9）对ABA有响应［27］。在拟南芥CBP60家族成员中，AtCBP60a、AtCBP60g、AtSARD1参与低温诱导的水杨酸的合成［1］。Peres等研究发现，EL2编码了一种新型植物CDK（cyclin-dependent protein kinase）抑制剂，将细胞周期进程与生物、非生物应激反应联系起来，而非生物胁迫如低温和干旱诱导了EL2 mRNA的表达［28］。

GO功能分析结果也表明，这些共同差异基因的功能主要集中在细胞过程、代谢过程和生物调控上。利用Cytoscape 3.9.1-MCODE筛选得到2个关键子网络，这2个关键子网络所涉及的7个基因都属于重点关注的10个关键基因。结合以上分析，在水稻的耐冷育种中，可以重点考虑上面提到的10个关键基因。本研究为水稻的耐冷育种提供了一定的理论依据，奠定了良好的基础。

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