果胶甲酯酶抑制剂的异源表达及其在果酒降甲醇中的应用

闫统帅，周浩洋，王泽翔，何娇娇，梁思宇，周世水*

（1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510640）

（2.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）

（3.石湾酒厂集团股份有限公司，广东佛山 528031）

果酒是水果发酵成的低酒精度饮料酒，很好的保留了水果中的营养成分，但是在果酒发酵过程中不可避免的生成甲醇[1]。由于甲醇为视神经毒物，可造成暂时或永久视力障碍[2]，同时甲醇还会在人体缓慢代谢成毒性更大的甲醛和甲酸，人误食5 g以上甲醇就会严重中毒甚至死亡[3]，因此降低果酒中甲醇具有重要的研究意义。

果酒发酵中的甲醇主要来自水果果胶的水解[4,5]，在内源果胶甲酯酶的作用下果胶被分解成果胶酸和甲醇[6,7]。目前研究常采用高温热处理钝化果胶酶[8-10]和清汁发酵[11]来降低果酒中的甲醇，两种处理方式都会使果酒的果香和口感品质降低，而添加果胶甲酯酶抑制剂（Pectin Methylesterase Inhibitor，PMEI）有望解决这一难题。Wu 等[12]在爱玉果中提取出一种PMEI，可有效降低杨桃果酒发酵中的甲醇，Wang 等[13]进一步表征其为复合的单宁类似物，Hou等[14]发现葡萄中添加没食子酸或香豆酸也可以降低甲醇并增加酒中保健成分。此外，来源于绿茶中的儿茶素和植物组织的根皮苷对果胶甲酯酶也具有抑制活性[15,16]，从而具有降低果酒中甲醇的潜力，但也存在含量低、提取复杂的难题。有报道来源于猕猴桃的PMEI 可以抑制果胶水解[17]，从而维持果汁的浊态[18]，且能在毕赤酵母中进行异源表达[19]，若将其应用于果酒发酵则有望降低果酒中的甲醇。

本研究将从猕猴桃中克隆出的PMEI 基因，利用双酶切连接到表达载体pPICzαA 上，电转化到毕赤酵母GS115 中获得PMEI 异源表达的工程菌株GS115/pPICzαA-PMEI，并将表达纯化后的PMEI 应用到果酒发酵来降低果酒中的甲醇，这为低甲醇果酒的发酵提供了新的技术路线。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

毕赤酵母表达菌株GS115，质粒pPICZαA 均为本实验室保存，大肠杆菌DH5α感受态细胞购自金沙生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂

ApexHF HS DNA 聚合酶预混液、DNA 凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、GL DNA Marker 5000，湖南艾科瑞生物科技有限公司；EcoRI、XabI、T4 DNA 连接酶、BMGY 培养基、BMMY 培养基，购自上海生物工程有限公司，博来霉素（Zeocin）、1xPBS缓冲液，北京普博欣生物科技有限责任公司；乙酸丁酯、丙酮（均色谱纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；22 种白酒标准品，滕州中科普仪器有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

T100 聚合酶链式反应基因扩增仪，大龙兴创实验仪器股份公司；Tanon EPS 300 电泳仪，上海天能科技有限公司；Gel Doc2000 凝胶成像分析系统、411BR 电转化仪，美国Bio-Rad 公司；5804R 高速台式冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；GC8100 气相色谱仪，滕州中科普仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒的构建及鉴定

根据GeneBank 中的猕猴桃PMEI 基因序列，利用软件Primer 5.0 进行引物特异性设计，并在其两端加入酶切位点EcoRI 和XbaI，所设计的引物如表1 所示，由上海生工有限公司合成。重组质粒pPICZαA-PMEI 的构建如图1 所示，以反转录出的猕猴桃的cDNA 为模板，利用引物对PMEI-F 和PMEI-R 扩増大小为480 bp 的目的基因，将获取的目的基因与表达质粒pPICzαA 进行双酶切连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α，用引物PMEI-A/D 进行菌落PCR 筛选，并提质粒进行酶切验证[20]。

图1 构建重组质粒pPICZαA-PMEI 示意图Fig.1 Construction of recombinant pPICZαA-PMEI

表1 本实验所用的引物Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.2 重组毕赤酵母的构建及验证

将线性化的表达质粒pPICZαA-PMEI 电转化到毕赤酵母GS115 中，涂布于含有100 μg/mL Zeocin 抗性的YPD 平板上，30 ℃避光培养2～3 d，挑取抗性平板上的阳性菌落，用引物PMEI-F/R 进行菌落PCR 验证。

1.2.3 重组毕赤酵母诱导表达PMEI

参照梅晓宏等[21]的发酵条件对重组毕赤酵母进行诱导表达，挑取重组毕赤酵母菌于25 mL BMGY培养基中28 ℃、200 r/min 培养到OD600nm=3.0～6.0。4 ℃，4 000 r/min 离心5 min 收集菌体，用50 mL BMMY 培养基重悬菌体并转入250 mL 三角瓶中继续培养，每24 h 补加0.5 mL 甲醇，诱导表达120 h后离心收集上清。

1.2.4 PMEI的鉴定与浓缩纯化

将取少量表达上清用甲醇氯仿进行10 倍浓缩抽提后进行SDS 聚丙烯凝胶电泳，观察蛋白条带是否符合预期。用φ=80%的硫酸铵将上清中的蛋白质进行沉淀，用1 倍体积PBS 缓冲液重悬沉淀，并用34 nm 14 000 u 的透析袋4 ℃过夜透析脱盐，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，并估算重组毕赤酵母菌的表达量，然后-80 ℃冻存备用。

1.2.5 PMEI在果酒发酵中的应用探究

将桔子、苹果、葡萄打浆，分别取80 mL 到100 mL 的烧杯中，加入1%（V/V）PMEI，对照组加入1%（V/V）PBS 缓冲液，接种0.1%（m/V）的果酒酵母，24 ℃发酵4 d 后用纱布过滤出酒液，静止12 h 后取样品测定甲醇和杂醇油含量，并测定酒精度、还原糖和总酸。

1.2.6 PMEI在桔子酒发酵中的最小抑制浓度

将桔子浆汁和过滤后桔汁按80 mL 每份分装到100 mL 的烧杯中，实验组分别添加0、0.25%、5%、0.75%和1%（V/V）的初步纯化过的PMEI，对照组则添加对应量的PBS 缓冲液，全部接种0.1%（m/V）的果酒酵母于30 ℃进行发酵，发酵结束后用纱布过滤并测定其甲醇含量。

1.2.7 PMEI在桔子酒发酵中的最适温度

将桔子浆汁按80 mL 每份分装到100 mL 的烧杯中，按体积比添加0.5%（V/V）的初步纯化过的PMEI，对照组则对应添加0.5%（V/V）的PBS 缓冲液，将桔子捣碎并接种0.1%（m/V）的果酒酵母，分别置于18、21、24、27 和30 ℃发酵，发酵结束后过滤上清测定甲醇含量。

1.2.8 测定方法

甲醇、杂醇油和酒精度：采用气相色谱法测定[22,23]；还原糖：DNS 测定法[24]；总酸：采用电位滴定法测定[25]。

1.2.9 数据分析

采用SPSS 28.0 进行数据统计分析，结果用“平均值±标准差”表示，由Graphpad 8.02 对数据进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 pPICzαA-PMEI表达载体的构建

在Zeocin 平板上生长的转化子的菌落PCR 如图2a 所示，条带784 bp 的为连载成功的表达载体，条带377 bp 的为空载体，随机挑选含有目的基因的阳性克隆进行质粒提取，利用EcoRI 和XbaI 进行双酶切验证，酶切结果如图2b 所示，电泳显示三个条带，分别为未酶切完全的重组质粒pPICZαAPMEI，双酶切形成的pPICZαA 和PMEI，条带大小分别为4 000、3 530、470 bp。

图2 pPICZαA-PMEI 表达载体的构建Fig.2 Construction of pPICZαA-PMEI expression vectors

图3 重组毕赤酵母菌落PCR 验证Fig.3 Colony PCR verification of recombinant Pichia pastoris

2.2 重组菌株GS115/pPICzαA-PMEI的筛选

取电转化后涂布在Zeocin 抗性平板上长势良好的酵母进行菌落PCR 验证，所挑选的5 个转化子均能扩增480 bp 的目的基因，这表明PMEI 基因已被成功整合到毕赤酵母GS115 的染色体上。

2.3 PMEI的表达与纯化

pPICzαA 因无法筛选高拷贝菌株而表达量较少，故对表达上清采用10 倍浓缩处理。蛋白质电泳如图4 所示，上清中没有太多的杂蛋白，预测目的蛋白为19.8 ku，这与以往PMEI 在毕赤酵母中表达的条带相近[19,26]，与大肠杆菌中表达的条带相差较大[27]，在目的蛋白条带下方有一条杂带，推测可能是去糖基化修饰的原始条带 （17 ku）[28]。将50 mL 表达上清用硫酸铵沉淀、透析后得到10 mL 纯化的PMEI，测定其蛋白质量浓度为176.88 mg/L，因此菌株表达PMEI的量约35.38 mg/L，这与曹等用GAP 启动子构建的组成型表达菌株表达量相近（66 mg/L）[26]，但远低于Mei 等[19]构建的高拷贝表达菌株的表达量（200 mg/L）。

图4 毕赤酵母表达上清蛋白质电泳Fig.4 SDS-PAGE of expresses supernatant by Pichia pastoris

2.4 PMEI在果酒发酵中的应用探究

将1%（V/V）的PMEI 分别添加到桔子、苹果和葡萄的果浆中发酵，发酵结束后气相测定甲醇含量如图5 所示。由图5 可知PMEI 在桔子酒发酵中降低甲醇效果最显著，甲醇含量由189.75 mg/L 降低到99.55 mg/L，降低47.54%（P＞0.05）。苹果酒中甲醇含量由118.15 mg/L 降低到91.20 mg/L，降低25.12%（P＞0.05）。葡萄酒中甲醇含量由17.60 mg/L 来到15.90 mg/L，甲醇变化不显著（P＜0.05）。PMEI对果酒发酵其他成分影响如表2。从表2 可知添加抑制剂对果酒的酒精度和还原糖影响小，而总酸都有下降。在果酒酒精度较低时，抑制剂使果酒中的杂醇油显著增加，酒精度较高时杂醇油则变化不显著。

图5 PMEI 对三种水果发酵甲醇含量的影响Fig.5 Effect of PMEI on methanol content in three fruits fermentation

表2 PMEI对果酒发酵中其它指标的影响Table 2 The effect of PMEI on other indicators in fruit wine fermentation

发酵果酒中的甲醇含量主要与水果中果胶含量和内源性果胶甲酯酶有关[3]，水果中甲酯化的果胶在发酵过程中由果胶甲酯酶分解形成果胶酸和甲醇，而PMEI 能和果胶甲酯酶形成1:1 非共价可逆复合物从而抑制其活性[29]，因此导致发酵果酒中甲醇含量降低和酸度降低，而抑制剂的添加由于引入了外源氨基氮，在糖代谢途径弱而氨基酸代谢途径强时显著增加杂醇油的含量[30]。由于各种水果甲酯化的果胶含量以及自身果胶甲酯酶特性不同，PMEI对不同水果发酵中甲醇的降低存在较大差异，葡萄中的果胶酶活性较弱，自然条件下发酵甲醇含量较低，PMEI 的抑制效果不显著，而桔子中果胶含量丰富，内源性果胶甲酯酶活性也较强，梅等的研究也表明PMEI 与来源于桔子的果胶甲酯酶的结合能力较强[31]，因此PMEI 在桔子酒发酵中降低甲醇的效果最佳。

2.5 PMEI在桔子酒发酵中的最低抑制浓度

通过测定不同添加量的PMEI 确定其在桔子酒发酵中的最小抑制质量浓度，结果如图6 所示。结果显示，两种发酵条件下桔子酒中的甲醇有较大的差异，由于桔子酒中的果胶主要存在于果渣中，因此桔子浆发酵的桔子酒甲醇含量偏高。此条件下添加0.5%（V/V）的PMEI 可使桔子酒中甲醇降低53.27%，由120.90 mg/L 降低到56.50 mg/L，因此确定PMEI 在桔子酒发酵中最适质量浓度8.84 mg/L。桔子汁发酵的桔子酒甲醇含量都低于30 mg/L，PMEI添加量也在0.5%（V/V）时甲醇含量最低，此时甲醇含量由26.90 mg/L 降低到19.80 mg/L，降低26.39%。

图6 不同PMEI 添加量对桔子酒中甲醇含量的影响Fig.6 Effects of different PMEI addition on methanol content in orange wine

2.6 PMEI在桔子酒发酵中的最适温度

测定不同温度条件下桔子酒中的甲醇浓度，结果如图7 所示。不添加PMEI 时发酵桔子酒中甲醇含量随着温度的降低而降低，原因是内源性果胶酶活性随温度降低[32]，但是较低发酵温度又不利于降低甲醇，这是因为低温导致发酵时间延长而使甲醇含量上升。当添加PMEI 时，发酵桔子酒中甲醇含量都显著下降，甲醇降低比随温度降低而升高，在18 ℃时甲醇降低比达66.40%，甲醇含量由265.15 mg/L 降低到89.10 mg/L。但在发酵温度21 ℃时，甲醇含量最低为83.30 mg/L，与18 ℃发酵甲醇含量相接近，此时甲醇降低比为58.78%。由于PMEI 在低温时对果胶甲酯酶抑制能力较强，且低温发酵有利于果酒果香的保留，因此确定添加PMEI 发酵桔子酒的最适温度为18 ℃。

图7 不同温度条件下PMEI 对桔子酒中甲醇含量的影响Fig.7 Effect of PMEI on methanol content in orange wine under different temperature conditions

3 结论

本研究成功构建了PMEI 基因异源表达的毕赤酵母工程菌株GS115/pPICzαA-PMEI，将发酵表达的PMEI 进行浓缩纯化后用于果酒发酵。研究结果表明，添加PMEI 发酵的桔子酒中甲醇降低47.54%，苹果酒中甲醇降低21.52%，而葡萄酒中甲醇变化不显著，同时添加PMEI 还对果酒酸度有一定的降低作用。添加PMEI 的桔子酒发酵工艺优化的PMEI 最低浓度为8.84 mg/L，最适温度18 ℃，此时桔子酒中甲醇降低比最高为66.40%。这为发酵果酒降甲醇提供了新的技术思路。