植物提取物A对SD大鼠更年期综合征的缓解作用

葛亚中，金鑫，欧颖仪，高艺敏

（1.无限极（中国）有限公司，广东广州 361100）

（2.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

更年期是女性逐渐步入老年期的过渡阶段，更年期女性的卵巢功能会从旺盛状态逐渐衰退直到完全衰竭[1]。女性在更年期期间由于内分泌失调以及性激素的分泌紊乱，会出现一系列心理与生理上的变化。在此期间出现的一系列心理和生理方面的病症被统称为更年期综合征，涉及了神经系统、心血管系统、骨代谢[2]等多方面，主要表现为头痛、潮热、血压升高、记忆力减退、骨质疏松[3]等，这直接地影响月经停止后女性生理健康和老年生活质量。

更年期期间的女性体内的性激素分泌会发生变化，如雌激素、抗苗勒氏管激素分泌减少；促卵泡生成素、促黄体生成素分泌增加；这些变化极大地影响更年期女性的身体健康。激素的变化也会带来一系列的症状，绝经后骨质疏松（Postmenopausal Osteoporosis，PMOP）是更年期综合征的重要表现，约有25%～30%的女性在月经停止后都患有骨质疏松[4]，PMOP 人群可占到整体骨质疏松人群的80%。调查研究表明，骨质疏松在老年女性中的发病率约为男性的3 倍[5]，雌激素水平下降常常被认为是导致PMOP 的重要因素。雌激素可促进骨生成，减少骨吸收，故更年期女性体内雌激素与雄激素的平衡状态被打破，雌激素水平大幅降低[6]，进而诱发骨质疏松。

更年期综合征尤其是骨质疏松严重威胁老年女性的健康，如何预防、减轻更年期综合征，平缓度过更年期始终是备受关注的课题。目前针对更年期综合征在临床上主要采用激素替代疗法（HRT），直接补充雌激素可以有效缓解绝经后骨质疏松[7]。然而，有研究表明对患者进行外源性雌激素补充，若长期作用或剂量控制不佳，有导致乳腺癌、子宫内膜癌[8]等疾病的风险。且激素替代疗法并不适用于所有女性，有研究表明，对于肥胖女性，使用激素替代疗法可能会加剧她们的血栓风险[9]。此外，目前市面上一些用于治疗更年期综合征的药物存在风险，如雷洛昔芬[10]，其在调节更年期综合征、骨质疏松上的功效被广泛认可，但是已有报道显示它存在诱发血凝块的风险。因此，人们更倾向于使用来源天然且安全的功能食品缓解更年期综合征及骨质疏松[11]，但目前市面上此类产品仍存在空白。本研究将研究植物提取物A 在缓解更年期综合征，尤其是调节更年期大鼠性激素分泌以及更年期导致的骨质疏松方面的作用，为其在功能食品方面的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与设备

1.1.1 样品

植物提取物A 由无限极（中国）有限公司提供，1 片为730 mg，每片含大豆提取物100.02 mg、鼠尾草提取物50 mg、百合提取物150 mg、墨旱莲提取物15 mg、甲萘醌7（维生素K2）35 μg、d-α-生育酚琥珀酸酯8.617 mg。

1.1.2 实验动物

使用SPF 级的雌性SD 大鼠（购入时体质量152.0～198.3 g，正式实验时体质量（197.6～266.3 g），试验动物由珠海百试通生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2020-0051，实验动物质量合格证明编号44822700001637。对购入SD 大鼠检疫7 d。检疫期间为群养，每箱4 只，造模后为每箱4 只，饲养温度与湿度：20～26 ℃，40%～70%，采用12 h:12 h 昼夜间断照明；饲养室条件始终保持稳定，以保证试验结果的可靠性。试验期间动物均按实验要求喂以相应颗粒饲料，所有饲料由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供。动物自由进食饮食。

1.1.3 主要仪器设备

JSB3-01 电子天平，上海浦春计量仪器有限公司；Discovery A 双能X 线骨密度仪，Hologic 公司；台式离心机，Sigma 3K15；超纯水制备机，雷磁UPW-N30UV；全自动生化分析仪，SHINOVA chemo 120V；55AA 型火焰原子吸收分光光度计，美国Agilent Technologies。日本岛津高性能液体色谱仪HLPC，液质联用仪API 5500LC-MS/M 系统。

1.2 实验方法

1.2.1 造模方法

建立大鼠卵巢摘除模型[12]（OVX），分别设置空白组，模型组，植物提取物A 低、中、高剂量组。造模时吸入异氟烷麻醉，麻醉后动物俯卧位于背部肋脊角位置剃毛备皮，于肋脊角位置剪开约1 cm切口，看到脂肪团后，手术弯镊将脂肪团轻轻拉出，于脂肪团中可见粉红色或黄红色卵巢，结扎输卵管后剪除卵巢，并将脂肪和子宫角送回腹腔，同法剪除另一侧卵巢。空白组同法作背部切口，把卵巢和脂肪找到后送回腹腔内。逐层缝合肌肉和皮肤。术后连续3 d 肌注青霉素钠注射液。

对实验动物每天进行阴道细胞监测。在卵巢摘除后第5 天开始观察，连续5 d 观察大鼠阴道涂片，可观察到阴道弹性降低、阴道皱缩且伴随动情周期紊乱的雌性大鼠即为已经进入更年期，造模成功，进而开展植物提取物A 灌胃。

1.2.2 给药方法

完成更年期模型造模后各组动物喂饲无雌激素饲料至试验结束，造模后第5 天分别开始对各组进行按剂量灌胃相应的植物提取物A，空白对照组和模型组灌胃纯净水，高中低剂量组灌胃剂量分别为280、140 和70 mg/(kg.d)。灌胃频率为每天固定时间点，每天一次，连续灌胃14 周，直至模型组动物出现骨质疏松症状。

1.2.3 观察

试验开始每天观察动物的一般临床情况一次，至试验结束。试验开始、试验结束及每周称量体质量1 次。

1.2.4 性激素检测

对分离的血清，使用ELISA 试剂盒检测动物体内的激素水平，包括雌二醇，促卵泡激素以及抗苗勒氏管激素，按照说明书测定血清中的激素含量，对激素水平进行定量分析。

1.2.5 骨钙指标及骨代谢标志物检测

骨钙含量测定：取左侧股骨，用原子吸收法测定骨钙含量。

骨密度测定：取右侧股骨用骨密度仪测定股骨中点和股骨远心端骨密度。

血磷和血钙检测：对分离的血清，采用血磷浓度测定试剂盒和血钙浓度检测试剂盒对各处理组中收集的血清进行定量分析，计算血磷和血钙含量。

对分离获得的血清，利用相应的ELISA 试剂盒对大鼠血清中骨代谢调控激素25 羟维生素D、成纤维生长因子和骨转化标志物Ⅰ型前胶原交联C 末端肽、Ⅰ型前胶原N 端肽、碱性磷酸酶和骨钙素进行定量分析。

1.2.6 组织切片

对收集固定的子宫组织自来水洗涤，乙醇分级脱水，二甲苯透化，石蜡包埋。制备好的蜡块，进行切片厚度为4 μm。对固定的子宫组织进行切片苏木精伊红（Hematoxylin and Eosin，HE）染色，在显微镜下对切片观察分析各处理组之间的子宫组织面积，腔内大小，内膜情况及腺体数量的差异；

骨组织在制备前需要对骨进行脱钙，在骨组织固定后，使用盐酸甲酸甲醛液中对其脱钙处理，标本检查以手感有弹性、用大头针能轻松刺入为脱钙良好，所有标本脱钙后均放入自来水中反复冲洗30 min。后续操作如常规切片制备操作，纵向切成4 μm厚的切片。对切片进行苏木精伊红（Hematoxylin and Eosin，HE）染色并在显微镜下观察分析骨小梁结构及小梁面积的差异分析。

1.3 数据分析

所有数据采用（x-±s）表示，应用SPSS 21.0软件进行统计分析；计量资料数据方差齐，或数据经转换后方差齐，则采用单因素方差分析；若数据经转换后方差仍不齐，采用秩和检验进行统计分析。检验水平α=0.05。

2 结果与讨论

2.1 植物提取物A对更年期大鼠体质量影响

2.1.1 各组动物体变化

体质量是反映动物生长情况的重要参考指标，体质量出现异常升高下降时，则提示机体健康状况出现问题。由表1 可知，试验期间各组动物随灌胃时间延长体质量逐渐升高，未见体质量异常，试验期间无动物死亡。与空白组相比，其余各组在第2～14 周体质量更高，有统计学差异（P＜0.05）。与模型组相比，给药各组在各个时间点的体质量无统计学差异（P＞0.05）。

表1 大鼠体质量变化情况Table 1 Body weight change of rats during the experiment (g)

2.2 植物提取物A对更年期大鼠子宫及性激素分泌影响

2.2.1 子宫切片

由图1 可知，模型组大鼠的子宫显著缩小，子宫内膜变薄，子宫内膜上皮细胞及子宫腺上皮细胞呈水样变性、坏死，子宫腺体扩张，可观察到固有层少量的炎性细胞浸润。灌胃低、中、高剂量植物提取物A 后，子宫内膜上皮细胞、子宫腺上皮细胞水样变性减少，子宫腺扩张减少，未见明显的炎性细胞浸润，固有层细胞和肌层细胞排列紧密。这表明植物提取物A 可以改善更年期大鼠的子宫状态，其中高剂量组的改善效果最为显著。

图1 植物提取物A 对大鼠子宫的影响Fig.1 Effect of plant extracts A on rats uterus

2.2.2 雌二醇含量

雌激素如雌二醇（Estradiol，E2）、促卵泡激素（Follicle Stimulating Hormone，FSH）、抗苗勒氏管激素（Anti-Mullerian Hormone，AMH）在机体内的平衡与更年期综合征的发生密切相关。它们参与调节卵泡生长、发育、成熟以及排出的过程，雌激素水平的变化可以早期预测卵巢功能的潜在变化[13]。更年期转变与激素水平的改变有关，两个公认的激素特征是雌二醇显著下降和促卵泡激素显著上升[14]。抗苗勒氏管激素抑制卵泡生长，防止卵泡过早过快被消耗的作用，可以早期预测卵巢功能的潜在变化[15]。

如图2～ 图4 所示，摘除卵巢后模型组大鼠血清中E2含量、AMH 含量相较于空白组均显著降低（P＜0.05），而模型组大鼠血清的FSH 含量较空白组显著升高（P＜0.05），符合更年期激素变化特征。相较于模型组，灌胃植物提取物A 可以显著提高大鼠血清中的E2（P＜0.05）、AMH（P＜0.05），分别提高了33.33%、134.78%；灌胃植物提取物A 的大鼠血清中的FSH 含量相较于模型组降低了8.42%（P＜0.05）。在灌胃剂量70、140 和280 mg/(kg.d)的范围内，植物提取物A 对上述三种性激素的调节均具有剂量依赖性，随着灌胃剂量的升高，大鼠血清中E2、AMH 含量逐渐上升，FSH 含量逐渐降低。

图2 植物提取物A 对大鼠血清雌二醇含量的影响Fig.2 Effect of plant extracts A on the level of serum estradiol of rats

图3 植物提取物A 对大鼠血清促卵泡激素含量的影响Fig.3 Effect of plant extracts A on the level of serum follicle stimulating hormone of rats

图4 植物提取物A 对大鼠血清抗苗勒氏管激素的影响Fig.4 Effect of plant extracts A on the level of serum anti-Mullerian hormone of rats

植物提取物A 中含大豆提取物、鼠尾草提取物、百合提取物、墨旱莲提取物、维生素K、d-α-生育酚琥珀酸酯，丰富的营养成分可发挥缓解更年期综合征的作用。黎桂玉等[16]研究表明，大豆异黄酮能提高更年期大鼠血清E2水平至模型组的3.6 倍。李赛君[17]使用百合地黄汤合加味逍遥散联合西药治疗更年期综合征患者，连续服用30 d 后，联合服药组患者的血清E2水平高于单一用药组，血清FSH 水平低于单一用药组，且联合组治疗总有效率97.67%高于单一用药组78.94%（P＜0.05）。陈马兰等[18]复配使用女贞子和墨旱莲灌胃更年期大鼠，结果表明女贞子和墨旱莲可以提高更年期大鼠血清E2含量。佐兆杭等[19]建立卵巢衰老大鼠模型，使用不同剂量大豆膳食纤维连续灌胃4 周，结果表明大豆膳食纤维可以提高卵巢衰老大鼠中的E2以及AMH 含量，缓解卵巢衰老。

2.3 植物提取物A对更年期大鼠骨组织影响及骨质疏松缓解效果

2.3.1 各组大鼠骨组织切片

由图5 可知，与空白组相比，模型组软骨及生长板软骨细胞坏死，胞核固缩深染、碎裂或溶解消失，骨陷窝增大；生长板周围骨小梁溶解，呈无结构的嗜酸性物，周围可见大量的成骨细胞；皮质骨处结缔组织增生，并伴有炎性细胞浸润。骨小梁数量明显减少，排列疏松。经中、高剂量植物提取物A 干预后，骨组织症状有明显改善，植物提取物A 中剂量组的骨小梁数量较模型组增加，而高剂量组的骨组织接近于空白组状态，表明植物提取物A 可改善大鼠由更年期所致的骨质疏松。

图5 植物提取物A 对大鼠骨组织的影响Fig.5 Effect of plant extracts A on the bone tissue of rats

2.3.2 血磷和血钙含量

当进入更年期，雌激素的缺乏可导致机体内钙和磷的代谢紊乱。由表2 可知，与空白组对比，模型组血磷和血钙均显著降低（P＜0.05）；相较于模型组，灌胃不同浓度的植物提取物A 均可提高大鼠的血钙和血磷含量，且伴随剂量依赖性。与模型组相比，高剂量组大鼠血清中的血磷含量显著增加（P＜0.05）；但低、中剂量灌胃组大鼠血磷和模型组相比无显著性差异。高剂量组大鼠的血磷较模型组提高了14.04%，与空白组相比无显著性差异，表明高剂量植物提取物A 可显著缓解更年期大鼠血磷降低。

表2 植物提取物A对大鼠血磷和血钙含量的影响Table 2 Effect of plant extracts A on the levels of blood phosphorus and calcium of rats (mmol/L)

与模型组相比，灌胃低、中、高剂量的植物提取物A 后各组大鼠的血钙升高，分别升高了6.13%、9.03%和12.58%，均有统计学差异（P＜0.05）。且中、高灌胃剂量的植物提取物A 可以将大鼠的血钙水平回调至与空白组无显著性差异。上述结果显示植物提取物A 在一定程度上恢复了钙磷代谢稳态，缓解更年期血磷血钙降低所引起的潜在骨质疏松风险。Li 等[20]对比大豆异黄酮苷元和雌二醇对去卵巢更年期大鼠血清磷、钙含量的影响，结果表明大豆异黄酮苷元与雌激素具有相同的作用，可缓解去卵巢大鼠血清磷、钙含量的下降，灌胃大豆异黄酮苷元组较模型组分别提高了8.13%、27.71%。

2.3.3 骨密度和骨钙含量

骨质疏松主要以绝经后妇女和老年人多见，当进入更年期，机体内雌激素的紊乱会加速骨量流失进而导致骨质疏松的发生，骨密度如全骨骨密度、骨远端骨密度、骨中端骨密度以及骨钙含量是骨质疏松的直观指标。

由表3 可知，模型组更年期大鼠的全骨骨密度、骨远端骨密度、骨中端骨密度以及骨钙含量较空白组均显著降低（P＜0.05），分别降低了10.71%、10.34%、7.69%、32.64%，即更年期会伴随骨质疏松和骨密度降低；灌胃植物提取物A 后，大鼠的全骨骨密度、骨远端骨密度、骨中端骨密度以及骨钙含量均较模型组有显著提高（P＜0.05）且呈现剂量依赖性，分别提高了8.00%、7.69%、8.33%、34.87%。

表3 植物提取物A对大鼠骨密度和骨钙含量的影响Table 3 Effect of plant extracts A on the levels of bone mineral density and bone calcium of rats (g/cm2)

Li 等[20]使用大豆异黄酮苷元灌胃去卵巢更年期大鼠，连续灌胃90 d 后，样品组的骨密度较模型组显著提高且具有剂量依赖性。陈方耿等[21]调研了210 例围绝经期妇女的骨密度和维生素K2 水平，维生素K2 缺乏组妇女的骨密度水平显著低于维生素K2 正常组，Pearson 相关性分析表明围绝经期妇女维生素K2 与骨密度呈正相关。

2.3.4 骨代谢调控激素

血清25 羟维生素D（Serum 25-hydroxy Vitamin D, 25-OH-VD）可通过调节骨密度与骨组织微结构，进而调控骨质疏松的发生[22]。成纤维细胞生长因子（Fibroblast Growth Factor 23，FGF23）是一种主要由骨细胞产生的内分泌激素，可调节机体磷酸盐和维生素D 水平[23]。在人体的骨骼发育中，成骨细胞合成和分泌的骨碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）具有重要作用，ALP 主要作用于骨矿化过程，是骨形成必需的催化剂[24]。骨钙素（Osteocalcin，OC）是成骨细胞分泌的小分子非胶原蛋白，骨基质中含量最丰富的标志物，可直接反映骨形成和骨重建功能[25]。I 型前胶原C 端肽（C-terminal Telopeptide of Type I Procollagen，CTX-I）为I 型前胶原降解产物，当CTX-I 水平升高时，I 型胶原被破坏，继而破坏骨基质[26]。成骨细胞合成新型I 型胶原后，成骨细胞外的蛋白酶将I 型前胶原N 端肽（Procollagen I N-terminal Propeptide，PINP）从I 型前胶原中裂解而来。血清PINP 浓度反映骨新骨形成总量，是良好的骨形成指标[27]。它们可直接反映成骨细胞、破骨细胞的活动，其改变相对于骨密度而言往往表现地更早[28]，国际临床化学联合会骨标志物标准工作组已将血液中的CTX-I 和PINP 确定为预测骨折风险和监测骨质疏松症治疗的骨转换的参考标志物[29]。

由图6 可知，模型组大鼠的血清25-OH-VD水平较空白组显著降低（P＜0.05），灌胃低、中、高剂量的植物提取物A 后，各组大鼠的血清25-OH-VD水平呈现剂量依赖型提高，分别提高了11.73%、44.44%、78.40%，与模型组相比均有显著性增加（P＜0.05）。由图7 可知，模型组大鼠血清中FGF23 水平较空白组显著降低（P＜0.05），灌胃低、中、高剂量的植物提取物A 后，各组大鼠的FGF23水平均较模型组显著升高（P＜0.05）且呈现剂量依赖性，分别提高了14.21%、39.96%、60.21%。由图8 可知，模型组大鼠血清ALP 含量显著低于空白组（P＜0.05），灌胃低、中、高剂量的植物提取物A 后，大鼠血清中ALP 含量呈剂量依赖型升高；中、高剂量组较模型组具有显著性差异（P＜0.05），分别提高了20.00%、40.00%，且高剂量的植物提取物A 可将更年期大鼠血清中ALP 含量回调至与空白组无显著差异水平（P＞0.05）。由图9 可知，模型组大鼠血清OC 含量显著低于空白组（P＜0.05），灌胃低、中、高剂量的植物提取物A 后，大鼠血清中OC 含量呈剂量依赖型升高，分别提高了15.73%、25.81%、51.61%，且高剂量的植物提取物A 可将更年期大鼠血清中OC 含量回调至与空白组无显著差异水平（P＞0.05）。如图10 所示，模型组的大鼠CTX-I 含量比空白组显著升高（P＜0.05），而灌胃植物提取物A 后，CTX-I 含量有明显降低，且呈现剂量依赖性。其中植物提取物A 中、高剂量组大鼠血清中CTX-I 含量较模型组显著降低（P＜0.05），分别降低了22.46%、34.22%。由图11 可知，模型组的大鼠PINP 含量较空白组显著降低（P＜0.05），灌胃低、中、高剂量的植物提取物A 后，大鼠血清中PINP 含量呈剂量依赖型升高；中、高剂量组较模型组具有显著性差异（P＜0.05），分别提高了78.57%、128.57%。以上结果表明，植物提取物A可通过促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用来提高骨密度和改善骨的微结构。

图6 植物提取物A 对大鼠血清25 羟维生素D 含量的影响Fig.6 Effect of plant extracts A on the level of serum 25-hydroxy vitamin D of rats

图7 植物提取物A 对大鼠血清成纤维生长因子含量的影响Fig.7 Effect of plant extracts A on the level of serum fibroblast growth factor 23 of rats

图8 植物提取物A 对大鼠血清碱性磷酸酶含量的影响Fig.8 Effect of plant extracts A on the level of serum alkaline phosphatase of rats

图9 植物提取物A 对大鼠血清骨钙素含量的影响Fig.9 Effect of plant extracts A on the level of serum osteocalcin of rats

图10 植物提取物A 对大鼠血清I 型前胶原交联C 末端肽含量的影响Fig.10 Effect of plant extracts A on the level of serum C-terminal telopeptide of type I procollagen of rats

图11 植物提取物A 对大鼠血清I 型前胶原N 端肽含量的影响Fig.11 Effect of plant extracts A on the level of serum procollagen I N-terminal propeptide of rats

高美等[30]研究不同剂量大豆甙元对去卵巢大鼠骨矿沉积的影响，结果表明服用大豆甙元可以提高大鼠血清中血清25 羟维生素D 和骨钙素的含量。李小云等[31]的研究表明，百合的有效成分槲皮素可通过雌激素受体信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化，改善骨微结构。杨芳芳[32]的研究表明，口服鼠尾草中的有效成分丹参酮可抑制去卵巢大鼠的骨量流失，提高大鼠血清中骨形成指标骨钙素的含量。程敏等[33]建立大鼠骨质疏松模型，使用墨旱莲连续灌胃，结果表明墨旱莲可以提高骨转化指标如血清中碱性磷酸酶和骨钙素含量，且可提高骨密度。

3 结论

本文旨在探讨植物提取物A 在缓解更年期综合征，尤其是更年期导致的骨质疏松方面的改善作用。研究结果表明，植物提取物A 可改善更年期引起的子宫内膜及子宫腺上皮细胞坏死和炎性细胞浸润症状；还可调节更年期大鼠性激素分泌，提高血清中雌二醇、抗苗勒氏管激素含量，降低血清促卵泡激素，维持性激素稳态。并且植物提取物A 可显著改善更年期引起的骨质疏松、骨结缔组织增生和炎性细胞浸润症状；调节机体血钙、血磷代谢，有助于维持更年期大鼠的钙磷代谢稳态；减轻更年期大鼠骨钙降低情况，提高全骨骨密度、骨远端骨密度、骨中段骨密度，维护骨骼健康；提高更年期大鼠血清25 羟维生素D 水平，升高成纤维生长因子水平调节机体代谢，提高碱性磷酸酶、骨钙素含量，降低I 型前胶原交联C 末端肽含量，提高I 型前胶原N 端肽含量，通过促进骨形成、减缓骨吸收有效缓解更年期大鼠的骨质疏松。

综上，植物提取物A 可以通过改善子宫形态、调节相关性激素分泌、改善骨质疏松以起到改善更年期综合征的效果，此结论为植物提取物A 在功能食品上的应用提供数据支持。