外泌体在老年骨科疾病中治疗应用的研究进展

侯德淼 唐梓晋 李卓 熊礼顺 晏怡果

(南华大学衡阳医学院附属第一医院脊柱外科,湖南 衡阳 421001)

干细胞外泌体(Exo)的应用和临床治疗潜力已成为再生医学研究的新主流。干细胞Exo富含细胞因子、生长因子、信号脂质和调控小分子RNA(miRNA),在骨科系统、心血管系统、免疫系统、中枢神经等系统疾病的诊断和治疗中发挥着越来越重要的作用。间充质干细胞(MSCs)是目前研究中最常用的细胞类型之一,是治疗人类疾病的一种基于细胞的实验疗法。干细胞衍生的细胞外囊泡(EV),包括Exo和微囊泡(MV)。它们参与细胞间的通讯,对靶细胞的作用主要包括自分泌、旁分泌和远距分泌。蛋白质、代谢产物和核酸从Exo转运到受体细胞,并有效地改变细胞或组织的代谢和生物反应。此外,Exo还可以重新编程免疫细胞,并激活内源性修复途径,影响组织对损伤、感染和疾病的反应。

在骨关节炎(OA)、骨质疏松(OP)、椎间盘退变(IVDD)等多种老年骨科疾病的发病机制、诊断和治疗中干细胞Exo发挥着重要作用。Exo在调节复杂的细胞内途径方面的固有特性已使其在许多疾病的治疗控制中发挥了潜在的作用。Exo可以被设计成输送不同治疗的有效载体,包括短干扰RNA、反义寡核苷酸、化疗药物和免疫调节剂,并且具有将其输送到所需靶点的能力。本文就干细胞Exo的在骨科疾病中的发病机制,及其作为治疗载体在老年骨科疾病中的应用研究进展进行系统阐述。

1 OA

1.1骨髓MSCs(BMSCs)Exo BMSCs的Exo(BMSCs-Exo)可以影响细胞命运,包括增殖、迁移、侵袭和凋亡。Chen等〔1〕发现,BMSC-Exos可以挽救退行性软骨细胞的线粒体功能障碍,还可以通过抑制受体活化因子(RANK)L-RANK-肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子(TRAF)6信号通路抑制软骨下骨中破骨细胞的活性。还有一些研究发现〔2～4〕BMSC-Exo显著促进软骨和软骨下骨的再生和修复,还可以通过显著增加骨关节炎软骨细胞中合成代谢标记物的表达,并降低了分解代谢标记基因的水平,以防止OA软骨细胞凋亡〔5〕。

1.2滑膜MSCs(SMSCs)Exo SMSCs在体外表现出良好的软骨分化能力,关节内注射SMSCs可明显促进软骨修复,在实验动物模型中可用于治疗OA〔6〕。Tao等〔7〕发现转染miR-140-5p的SMSCs衍生的Exo(SMSC-140-Exos)不仅能促进软骨细胞的增殖和迁移,还能防止体外细胞外基质(ECM)损伤。此外,在大鼠OA模型中,SMSC-140-Exos治疗可显著减轻关节磨损,降低国际关节炎研究学会(OARSI)评分并延迟OA进展。此外,Zhu等〔8〕发现,SMSC-Exos不仅能促进体外软骨细胞的迁移和增殖,而且在胶原酶诱导的小鼠OA模型中,SMSC-Exos提高了国际软骨修复协会(ICRS)评分,低了OARSI评分,并维持了软骨内Ⅱ型胶原含量〔8〕。Guo等〔9〕使用Micro-CT分析显示SMSC-Exos显著改善了大鼠股骨头坏死的骨小梁的微观结构和矿物质密度。骨重塑(包括软骨下骨改变和骨赘形成)是OA过程中常见的现象,且与OA进展密切相关〔9〕,因此,SMSCs或其他细胞来源的Exo在OA发病过程中的骨重塑作用值得研究。

1.3脂肪MSCs(AMSCs)Exo AMSCs在软骨再生中有很强的潜力,被认为是治疗OA的良好细胞源。Tofio-Vian等〔10〕发现脂肪源性Exo介导对OA成骨细胞的旁分泌效应,显著降低与衰老相关β-半乳糖苷酶和γH2AX的活性。此外AMSC-Exos可以抑制TNF-α、白细胞介素(IL)-6、前列腺素(PG)E2和一氧化氮(NO)等促炎介质的产生,同时抑制基质金属蛋白酶(MMP)活性和MMP-13水平升高,同时提高抗炎细胞因子白细胞介素(IL)-10和软骨细胞特异性Ⅱ型胶原分子的水平〔11〕。Zhao等〔12〕通过人脂肪分离出的AMSC-Exos发现,Exo能上调miR145和miR221并下调促炎基因的表达促进软骨形成并抑制炎症。在一项活体实验中,Woo等〔13〕发现,AMSC-Exos可以增强人OA软骨细胞的增殖和迁移,并维持软骨ECM。

1.4胚胎MSC(EMSCs)Exo EMSCs的Exo能调节软骨细胞的生物学表型,能在OA模型中延缓OA进展〔14,15〕。Zhang等〔16〕在大鼠骨软骨损伤处注射人胚胎干细胞来源的Exo后,他们观察到软骨和软骨下骨的损伤在6 w时基本逆转,在12 w时几乎完全恢复,此外,这些Exo就能显著促进新组织形成和ECM质沉积,增加M2巨噬细胞浸润,减少M1巨噬细胞和促炎细胞因子的产生。与MSC相比,MSC-Exos在治疗OA时更为保险、便捷和高效。相信随着研究的更近一步,Exo将在OA的临床诊治中发挥更大的作用。

2 OP

OP是临床常见的老年慢性疾病,以骨量减少、骨脆性增加及骨微结构破坏为主要特征〔17〕。大量研究证据表明,Exo可以直接影响破骨细胞、成骨细胞和骨基质干细胞,以调节骨的形成和吸收〔18～20〕,也可以诱导MSC向骨细胞分化〔21〕。

2.1骨髓基质源性Exo Luo等〔22〕研究发现,骨髓基质细胞(ST)衍生的Exo(ST-Exos)在体外显著增强BMSCs的成骨分化。将ST-Exo传递到BMSCs中,让ST-Exo表面与BMSCs特异性适配子结合,形成ST-Exos复合物,再将ST-Exos复合物静脉注射到卵巢切除术(OVX)引起的OP小鼠模型中,结果证明了BMSCs特异性适配体功能化ST-Exos靶向增强OVX小鼠的骨量,加速小鼠股骨骨折模型的骨愈合〔22〕。Qiu等〔23〕及其团队利用BMSC-Exos进行了体内外实验,发现BMSC-Exos可减弱OP,阐明了Exo中miR-1503p上调可促进成骨细胞增殖分化。

2.2破骨细胞衍生Exo Zhu等〔24〕通过使用磁羟基磷灰石(MHA)支架改变破骨细胞来源的Exo,降低成骨细胞摄取Exo效率,促进了OP模型中的成骨细胞增殖,值得注意的是,在MHA刺激下,破骨细胞来源的Exo中,包括泛素、ATP和活性氧在内的某些蛋白质减少。

2.3内皮细胞源性Exo Song等〔25〕发现血管内皮细胞(EC)分泌的Exo(EC-Exos) 的骨靶向作用比成骨细胞来源的Exo或BMSC-Exo更强,EC-exos可以抑制破骨细胞活性,而且还发现EC-Exos内源性物质miR-155有治疗OP的潜力。

2.4Exos作为潜在的生物标志物在老年人OP早期诊断、临床干预和预后评估方面同样具有良好的应用前景〔26,27〕。不同细胞来源Exo对OP的作用机制主要涉及激活各种信号转导通路和调节基因的表达,从而影响骨重建过程中成骨细胞、破骨细胞和血管内皮细胞的生物学功能。但哪种细胞来源的ECM更适合作为治疗的新型生物制剂,仍需从Exo的产量、成骨能力等多因素综合分析。

3 椎间盘退行性病变(IVDD)

IVDD是与年龄有关的生物学改变,退变是衰老的过程。在IVDD过程中,髓核细胞的凋亡可能是髓核区域内细胞数量减少的重要原因〔28〕。MSC-Exos对IVDD的保护作用,有助于抑制髓核细胞(NPCs)的凋亡〔29〕。NPC吸收纯化的MSC-Exos,MSC-Exos中miR-21富集,而凋亡NPCs中miR-21水平下调。Exo中的miR-21通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT途径靶向磷酸酶和紧张素同源物(PTEN)〔31〕,转移到髓核细胞中,缓解TNF-α诱导的NPC凋亡〔29,30〕。此外,有研究〔31〕发现MSC-Exos可以调节内质网应激,抑制椎间盘退变期间髓核细胞过度凋亡,MSC-Exos通过激活AKT和ERK信号通路减弱内质网应激诱导的细胞凋亡。因此,MSC-Exos可以通过减少髓核细胞的死亡从而延缓IVDD的进展。

IVDD往往伴随着髓核ECM的丢失,椎间盘中炎性因子和基质降解酶的大量积聚是造成这种现象的重要原因〔28〕。有研究〔32〕利用兔IVDD模型验证了Exo降低核苷酸结合寡聚结构域(NLRP)3炎症小体表达用于IVDD治疗,结果证实NLRP3炎症小体是IVDD治疗的有效靶点。研究证明Exo对髓核细胞线粒体具有保护作用,因为Exo可以对抗H2O2对线粒体的作用,H2O2可以破坏线粒体结构,上调活性氧(ROS),从而激活硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)/NLRP3炎症小体和下游炎症介质IL-1β,进而诱导ECM变性,而Exo可下调NP细胞中ROS水平,减少炎症介质的释放,降低NP细胞凋亡。因此,MSC-Exos还可以通过减少ECM降解,进而延缓IVDD的进展。

不仅如此,软骨终板细胞的退变与IVDD也密切相关,有研究表明MSC-Exos能延缓软骨终板细胞的凋亡和钙化,从而延缓IVDD,有研究〔28〕通过叔丁基过氧化氢(TBHP)诱导的氧化应激细胞模型和IVDD大鼠模型得出这一结论,作者发现MSC-Exos下调凋亡相关蛋白的表达,使EPCs不受氧化应激导致凋亡和钙化,而且MSC-Exo还通过表达miR-31-5抑制内质网相关应激从而抑制EPCs凋亡和钙化〔33〕。此外,Luo等〔34〕发现,正常软骨终板干细胞来源的Exo(N-Exos)比退化的软骨终板干细胞来源的Exo(D-Exos)在体外和体内更能诱导自噬激活,并通过激活PI3K/AKT/自噬通路抑制髓核细胞凋亡和减缓IVDD的进展,Luo及其团队还发现软骨终板细胞在其自分泌Exo自分泌机制诱导下激活低氧诱导因子(HIF)-1α/Wnt信号通路,增加GATA结合蛋白4和TGF-β1的表达,从而促进软骨终板细胞向髓核迁移并向NPCs的转化,从而抑制IVDD〔35〕。

综上,干细胞来源的Exo能够促进髓核细胞的增殖,能够抑制凋亡;并且,通过抑制基质蛋白酶的积累,增加细胞外矩阵的合成,抑制分解,从而维持ECM稳定状态,抑制炎症因子的出现,减少细胞微环境对髓核细胞的干涉。Exo还可以作用于软骨终板,抑制软骨终板细胞的凋亡和钙化,促进终板软骨细胞分化为髓核细胞,抑制IVDD。随着研究的不断深入,相信干细胞Exo在治疗老年人IVDD方面能够起到更大作用。

4 肌腱损伤

肌腱损伤分急性损伤和慢性损伤。老年人常见的是慢性损伤,慢性损伤是肌腱长期反复经受轻微外伤,或肌腱本身有慢性磨损,导致腱纤维变性、变细、日后轻微扭伤即可造成肌腱断裂。肌腱干细胞(TSCs)是肌腱组织中发现的前体细胞,具有自我更新和分化的潜能,已广泛应用于组织工程和肌腱损伤修复中〔36〕。许多研究表明,TSCs的应用可以有效地促进损伤肌腱的修复和再生〔37～40〕。在一项研究中,Zhang等〔36〕发现,TSC-Exos能促进肌腱细胞的增殖和迁移,并呈剂量依赖关系。Ⅰ型胶原是正常肌腱胶原蛋白的主要成分,参与肌腱结构的形成及其力学性能〔41〕。然而,相对于Ⅰ型胶原,Ⅲ型胶原表达增加会抑制胶原纤维的生长,导致瘢痕形成〔42,43〕。研究表明,Ⅰ/Ⅲ型胶原的最佳比例可能是促进肌腱损伤高质量愈合的主要因素〔44〕。肌腱组织的生物力学性能与肌腱胶原纤维的直径密切相关,修复后胶原纤维直径较大的肌腱组织比正常胶原纤维修复的肌腱组织具有更强的力学强度〔45,46〕。在同一项研究中,研究人员发现TSC-Exos在抑制瘢痕形成、增强肌腱损伤愈合的生物力学性能方面发挥了重要作用。另外,TSC-Exos在体内早期炎症反应的过程中,发现通过调节与巨噬细胞相关的细胞因子来促进消炎和肌腱损伤的结合。这些发现证明了Exo在肌腱损伤修复中的潜在价值,也为TSC-Exos在肌腱损伤修复的临床应用中提供了有力的证据。

最后,Exo在细胞凋亡、免疫调节和组织再生也发挥着重要作用〔47〕。许多研究已经报道了BMSCs和AMSCs在体外对巨噬细胞极化的影响〔48～54〕。一些研究证实,AMSC-Exos能够在体外将巨噬细胞从M1表型调节为M2表型〔55～59〕。一项研究表明,将BMSC-Exos移植到肌腱损伤部位会促使巨噬细胞向M2表型分化,并降低M1/M2巨噬细胞比率〔60〕。同样,局部应用BMSC-Exos到髌腱窗伤口也促进了巨噬细胞从M1表型到M2表型的极化〔60〕。Shen等〔55〕研究发现,AMSC-Exos在肌腱愈合的最早阶段可以促进肌腱基质的再生,从而促进肌腱损伤修复。这些发现为肌腱损伤的生物治疗提供了新的契机。研究发现,miR-29家族具有抗纤维化活性〔61～64〕。Yao等〔65〕研究发现,miR-29a-3p可能是脐带间充质干细胞的Exos(UMSC-Exos)在肌腱愈合中发挥有利作用的关键miRNA。研究结果提示,PTEN/mTOR/TGF-β1信号通路可能是UMSC-Exos传递miR-29a-3p促进肌腱愈合的潜在途径,并为通过工程化干细胞来源的Exo进行肌腱再生提供了一种新的治疗策略。

5 肌肉损伤

骨骼肌挫伤是创伤和运动医学中最常见的损伤之一〔66〕,老年人雨雪天气受伤较为常见。由于挫伤后局部纤维化的形成,受伤的肌肉很容易再次损伤〔67〕。已经证明骨骼肌纤维化与损伤早期的过度炎症反应有关〔68,69〕。巨噬细胞与炎症浸润密切相关,在骨骼肌愈合过程中起关键作用〔66,70,71〕。据报道,挫伤后中性粒细胞大量渗入损伤区,导致早期局部炎性血肿和湿重增加〔72,73〕。研究证明,BMSC-Exos在其他组织中也有抗炎作用〔74～76〕。Luo等〔77〕发现,小鼠肌肉挫伤后肌肉注射BMSC-Exos可减轻炎症水平,BMSC-Exos在体内和体外均促进M2巨噬细胞极化,同时,BMSC-Exos减少炎症微环境下炎性细胞因子的产生,上调抗炎因子的表达从而减轻小鼠肌肉挫伤,促进肌肉愈合。为肌肉损伤后的生物治疗提供一种新的治疗策略。通常认为α-平滑肌肌动蛋白(SMA)是活化的纤维化细胞亚群的生物标志物,其表达水平可以反映纤维化的过程〔78〕,在同一项研究中研究人员发现BMSC-外源性治疗可能通过下调α-SMA蛋白的表达来降低纤维化水平。但BMSC-Exos在巨噬细胞耗竭后对肌肉纤维化和功能恢复的作用受到抑制,这也表明BMSC-Exo在肌肉愈合中的作用是通过调节巨噬细胞来实现的。此外,BMSC-Exos注射后的相对生物力学指标(快速收缩和强直强度)明显改善,挫伤后的肌力提高,肌肉愈合的生物力学性能增强。这些研究结果为BMSC-Exos在临床上用于肌肉愈合提供了有力的证据。

由于Exo在骨骼肌损伤和修复过程中选择性地装载内容物,因此可以在骨骼肌损伤修复过程中探究外泌体的不同内容物,对疾病发生的不同时间段进行优化治疗,大大改善老年患者的骨骼肌损伤状况。

综上,Exo是当前一个热门的研究领域。干细胞Exo富含细胞因子、生长因子、信号脂质和调控miRNAs,在OA、OP、IVDD等老年骨科疾病的诊断和治疗中发挥着广泛的作用,对修复肌腱损伤、肌肉损伤起到很大的作用。除了这些治疗潜力之外,Exo还有帮助诊断疾病的潜力。目前,Exo可以用于无细胞再生,为降低风险的无细胞干细胞治疗提供新的治疗模式。但是,再生医学在很大程度上取决于其生产的质量、可重复性和效力,这些参数同样决定了Exo疗法的发展。随着今后开发更多标准化的纯化和分析程序来研究Exo,这可能会揭示其功能异质性,为其在各种老年疾病中的作用提供了新的见解与方法。