混合型饲料添加剂中胆汁酸含量测定方法比较研究

聂倩倩 王 鑫 杨发树 杨 娟 张凤枰,4*

(1. 四川威尔检测技术股份有限公司,成都 610041;2. 上海海洋大学食品学院,上海 201306;3. 通威股份有限公司农业农村部水产营养与智慧养殖重点实验室,成都 610093;4. 宜宾学院质量管理与检验检测学部,宜宾 644007)

胆汁酸(BA)是胆汁的主要脂质成分,是动物体内胆固醇代谢过程中产生的固醇类物质。研究表明,添加外源性胆汁酸可提高动物对饲料的脂肪利用率、抗脂肪肝、增强免疫力、促进胆汁分泌、畅通胆道、杀菌等,在动物脂肪代谢中起重要作用[1-3],能有效促进养殖动物生长、显著改善养殖动物产品品质[4-6]。2014年胆汁酸被农业农村部批准为饲料添加剂,产品为混合型饲料添加剂,其主要成分为猪胆酸(hyocholic acid,HCA)、猪去氧胆酸(hyodeoxycholic acid,HDCA)和鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA),目前允许在断奶仔猪、淡水鱼和产蛋鸡配合饲料中限量使用[7-9]。目前国内已获得混合型饲料添加剂胆汁酸生产许可证的企业,尽管都是依据农业部备案标准生产的,但实际生产中由于采用的生产原料和生产工艺不尽相同,产品中的胆汁酸含量和规格不一、产品质量参差不齐。因此,饲料生产企业准确测定混合型饲料添加剂中3种胆汁酸含量、合规使用非常重要。目前,国内外已有关于饲粮中添加胆汁酸对养殖动物肝脏代谢、生长性能影响等的研究[10-14],但尚未见混合型饲料添加剂中胆汁酸含量测定的检测方法标准和相关文献报道。随着我国畜牧和水产养殖业混合型饲料添加剂胆汁酸应用越来越广泛,研究建立混合型饲料添加剂中胆汁酸含量的测定方法,对于混合型饲料添加剂胆汁酸生产企业产品质量控制、饲料企业科学规范使用胆汁酸具有重要意义。目前,国内外文献报道有关胆汁酸含量测定方法主要有薄层色谱法[15]、分光光度法[16]、高效液相色谱法[17-18]、气相色谱质谱联用法[19-20]和液相色谱质谱联用法[21-22]。薄层色谱法需要复杂的纯化前处理,其结果易受试验条件影响;分光光度法操作简单,但无法准确定量测定3种胆汁酸含量;气相色谱质谱联用法需要进行复杂的衍生处理,液相色谱质谱联用法样品需要净化处理,灵敏度均特别高,不适合含量较高的饲料添加剂胆汁酸定量分析;高效液相色谱法样品前处理简单,线性范围、灵敏度等更适合混合型饲料添加剂胆汁酸主成分含量检测。本试验研究建立混合型饲料添加剂中3种胆汁酸含量的高效液相色谱-示差折光(HPLC-RID)法、高效液相色谱-荧光(HPLC-FLD)法,并与现有的重量法、容量法进行对比,明确4种方法的测定原理、测定对象、测定结果的差异,旨在为饲料和饲料添加剂生产企业选择适宜的混合型饲料添加剂中胆汁酸含量检测方法、加强混合型饲料添加剂胆汁酸产品质量控制及其科学规范使用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂和材料

1260高效液相色谱仪(Agilent公司)、KS-5200E超声波振荡器(昆山洁力美超声仪器有限公司)、Auto EVA 80氮吹仪(睿科仪器有限公司)、Multi Reax涡旋混合仪(Heidolph公司)、DZKW-4水浴锅(北京中兴伟业公司)、CP225d分析天平(Sartorius公司)、101-2AB电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业公司)。

猪胆酸标准品(纯度≥99.8%,北京曼哈格生物科技有限公司)、猪去氧胆酸标准品(纯度≥98%,上海源叶生物科技有限公司)、鹅去氧胆酸标准品(纯度≥97.3%,北京曼哈格生物科技有限公司)、甲醇和乙腈(色谱纯,成都市诺尔施科技有限责任公司)、4-溴甲基-7-甲氧基香豆素(纯度≥98%,上海安谱实验科技股份有限公司)、1,4,7,10,13,16-六氧杂环十八烷(纯度为99%,北京索莱宝科技有限公司)、氢氧化钾、三氟乙酸、磷酸、乙醚、无水乙醇、氢氧化钠、硫酸(均为分析纯,成都市科隆化学品有限公司)、Milli-Q Gradient超纯水(美国Millipore公司)。

混合型饲料添加剂胆汁酸样品由通威股份有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 HPLC-RID法

1)标准溶液配制:准确称取猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸标准品各约5.00 mg(精确至0.1 mg)于10 mL容量瓶,用甲醇溶解、定容,混匀,制备成质量浓度为500 μg/mL的胆汁酸混合标准储备溶液。取适量胆汁酸混合标准储备溶液,用甲醇稀释成质量浓度分别为2、5、10、20、50、100和200 μg/mL的胆汁酸混合标准系列溶液。

2)试样溶液制备:称取混合型饲料添加剂胆汁酸试样200 mg(精确至0.1 mg)于100 mL容量瓶中,加流动相(甲醇+乙腈+水=110+100+90,v/v,pH=2.6)约70 mL,常温超声30 min,取出,冷却至室温,用流动相定容至100 mL,混匀,用0.45 μm微孔滤膜过滤,待HPLC-RID分析。

3)高效液相色谱条件:Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱,长150 mm,内径4.6 mm,粒径5 μm;流动相为甲醇+乙腈+水=110+100+90(v/v),用磷酸调pH至2.6;流速为1.0 mL/min;检测池温度为40 ℃;柱温为40 ℃;进样量为20 μL。

1.2.2 HPLC-FLD法

1)标准溶液配制:同1.2.1。

2)试样溶液制备:称取混合型饲料添加剂胆汁酸试样200 mg(精确至0.1 mg)于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解、定容,混匀。准确移取0.5 mL胆汁酸混合标准溶液和试样溶液,分别置于10 mL具塞试管中,准确加入2.5 mL 1.8 mmol/L氢氧化钾甲醇溶液,涡旋混合1 min,55 ℃水浴皂化10 min,55 ℃氮气吹干,准确加入0.5 mL 10 mmol/L 4-溴甲基-7-甲氧基香豆素乙腈溶液、0.5 mL 5 mmol/L 1,4,7,10,13,16-六氧杂环十八烷乙腈溶液,加塞密封,涡旋混合1 min,在避光条件下,65 ℃衍生反应2 h,取出,冷却至室温。用0.45 μm微孔滤膜过滤,待HPLC-FLD分析。

3)高效液相色谱条件:Thermo Scientific Acclaim 120 C18色谱柱,长250 mm,内径4.6 mm,粒径5 μm;流动相中A相为0.05%三氟乙酸溶液,B相为乙腈;流速为1.0 mL/min;检测波长为荧光激发波长为330 nm,发射波长为410 nm;柱温为25 ℃;进样量为10 μL。流动相梯度洗脱程序如表1所示。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.2.3 重量法

参考《中华人民共和国药典(2015年版一部)》[23]中的猪胆粉法,稍作修改,试验步骤如下:称取试样0.5 g(精确至0.1 mg),置于250 mL三角瓶中,加无水乙醇20 mL,连接冷凝回流装置,加热回流30 min,过滤,滤渣用无水乙醇10 mL洗涤,洗液与滤液合并,蒸干,加15%氢氧化钠溶液30 mL、乙醇1 mL,加热回流6 h,再加水30 mL,摇匀,滤入分液漏斗中,滤渣使用热水20 mL洗涤,与滤液合并,稀硫酸调pH至酸性(pH=2～5),放至室温,再用乙醚振摇提取4次(50、50、30、30 mL),合并乙醚提取液,用水洗涤2次,每次10 mL,乙醚液滤过,滤器用10 mL乙醚洗涤,洗液与滤液合并于干燥至恒重的250 mL锥形瓶中,旋转蒸发,回收乙醚,105 ℃干燥至恒重,计算公式如下:

X=100×(W1-W0)/m。

式中:X表示样品中胆汁酸含量(%);m表示样品重量(g);W1表示三角烧瓶+提取物恒重的重量(g);W0表示三角烧瓶恒重的重量(g)。

1.2.4 容量法

参考某饲料添加剂生产企业胆汁酸检测方法,试验步骤如下:称取试样适量(约含有胆汁酸0.5 g,精确至0.1 mg),置于250 mL三角瓶中,用50 mL 95%乙醇超声溶解,滤纸过滤,滤液加酚酞指示剂2滴,用0.1 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液进行滴定,至试样溶液变粉红色且30 s内不褪色为止,同时做空白试验。计算公式如下:

X=100×[c×(V-V0)×392.6]/m。

式中:X表示样品中胆汁酸含量(%);c表示氢氧化钠标准溶液浓度(mol/L);V0表示空白试验消耗氢氧化钠标准溶液的体积(mL);V表示滴定样液时消耗氢氧化钠标准溶液的体积(mL);m表示样品质量(mg)。

1.3 统计方法

采用Excel 2021软件进行数据统计分析,采用Origin 2021软件进行作图,结果以平均值±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 HPLC-RID方法研究

2.1.1 样品前处理条件优化

试验使用流动相(甲醇+乙腈+水=110+100+90,v/v,pH=2.6)作为胆汁酸提取溶液,考察不同提取时间(10、20、30和40 min)、不同提取温度(20、30、40、50和60 ℃)对3种胆汁酸含量测定结果的影响,如图1所示。结果表明,随着提取时间的延长,3种胆汁酸含量不断升高,30 min时达到最高;随着提取温度的变化,3种胆汁酸含量发生改变,30 ℃时达到最高,30～60 ℃逐步下降,因此,最终确定提取时间为30 min、提取温度为30 ℃。

HCA:猪胆酸 hyocholic acid;HDCA:猪去氧胆酸 hyodeoxycholic acid;CDCA:鹅去氧胆酸chenodeoxycholic acid。下图同 the same as below。

2.1.2 色谱条件选择和优化

试验比较了流动相A(甲醇+乙腈+水=140+120+40,v/v)、流动相B(甲醇+乙腈+水=110+100+90,v/v)3种胆汁酸色谱峰的分离效果,如图2所示。结果表明,采用流动相A,猪胆酸、猪去氧胆酸未分开,3种胆汁酸色谱峰分离效果不佳,有拖尾现象;而采用流动相B,3种胆汁酸完全分开,色谱峰峰形尖锐、分离效果较好。不同品牌C18色谱柱对3种胆汁酸的分离效果有一定差异,其中短柱(Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱)保留时间提前,峰形较好。另外,采用示差检测器测定,柱温对色谱峰的响应值及保留时间影响较大,试验比较了不同色谱柱温度(30、35、40和45 ℃)3种胆汁酸色谱峰分离效果,结果表明,当色谱柱温度为40 ℃时,目标物色谱峰分离效果较好、响应值较高。

图2 不同流动相(A)、色谱柱(B)和色谱柱温度(C)下3种胆汁酸色谱图

2.1.3 方法学考察

取“1.2.1”制得的混合标准溶液,按照优化后的前处理及色谱条件进行测定,各目标化合物的质量浓度为横坐标,以对应的色谱峰面积为纵坐标,线性拟合得各目标化合物在一定线性范围内线性回归方程,并计算其定量限(S/N≥10.0,P/P)。称取200 mg添加剂预混料样品,按照优化后方法对预混料样品进行3个浓度水平的加标回收试验,各浓度水平分别进行4次重复测定,计算其回收率及测定值的相对标准偏差(RSD),结果如表2所示。

表2 3种胆汁酸线性范围、线性回归方程、相关系数、回收率、相对标准偏差和定量限

2.2 HPLC-FLD方法研究

2.2.1 皂化条件选择

考察不同皂化温度(30、40、50和60 ℃)、不同皂化时间(10、20、30和40 min)、不同氢氧化钾甲醇溶液添加量(1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mL)对猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸含量测定结果的影响,如图3所示。皂化温度、皂化时间对胆汁酸含量测定结果影响并不大,考虑到皂化后需要进行55 ℃氮吹,因此最终选择胆汁酸皂化温度为55 ℃、皂化时间为10 min;3种胆汁酸含量随着氢氧化钾甲醇溶液(1.8 mmol/L)添加量的增加而增大,当添加量为2.0～2.5 mL时,3种胆汁酸含量测定结果达到最高值,且随着氢氧化钾甲醇溶液添加量的增大,测定结果不再增加,因此,最终确定氢氧化钾甲醇溶液添加量为2.5 mL。

图3 不同皂化温度(A)、皂化时间(B)和KOH甲醇溶液添加量(C)下3种胆汁酸含量变化曲线

2.2.2 衍生条件选择

其他条件不变,考察不同衍生温度(50、65、70和80 ℃)、不同衍生时间(1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h)对猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸含量测定结果的影响,如图4所示。随着衍生温度的升高,3种胆汁酸含量测定结果不断升高,65 ℃达到最高点,经过多次试验,当衍生温度高于70 ℃时,试管塞易被蒸汽冲开造成损失,测定结果不稳定,因此选择衍生反应温度为65 ℃;随着衍生时间的延长,3种胆汁酸含量测定结果不断升高,2 h时达到最高点,高于2 h后各胆汁酸含量测定结果变化趋于稳定,表明衍生反应完全,最终选择衍生时间为2 h。

图4 不同衍生温度(A)、衍生时间(B)下3种胆汁酸含量变化曲线

2.2.3 色谱条件选择和优化

为了获得良好分离度,试验比较甲醇-乙腈-水体系、三氟乙酸-乙腈体系流动相对3种胆汁酸色谱分离效果、保留时间和响应值的影响,同时,比较不同品牌C18色谱柱3种胆汁酸色谱分离效果,如图5所示。以三氟乙酸-乙腈体系作为流动相时,3种胆汁酸色谱峰的峰形较好,响应值较高;长柱(Thermo Scientific Acclaim 120 C18色谱柱)分离效果较好,峰形尖锐不拖尾,响应值较高。

图5 不同流动相(A)、色谱柱(B)下3种胆汁酸色谱图

2.2.4 方法学考察

取“1.2.2”制得的混合标准溶液,按照优化后的前处理及色谱条件进行测定,各目标化合物的质量浓度为横坐标,以对应的色谱峰面积为纵坐标,线性拟合得各目标化合物在一定线性范围内线性回归方程,并计算其定量限(S/N≥10.0,P/P)。称取200 mg添加剂预混料样品,按照优化后方法对预混料样品进行3个浓度水平的加标回收试验,各浓度水平分别进行4次重复测定,计算其回收率及测定值的RSD,结果如表3所示。

表3 3种胆汁酸线性范围、线性回归方程、相关系数、回收率、相对标准偏差和定量限

2.3 HPLC-FLD和HPLC-RID方法比较

采用HPLC-RID和HPLC-FLD 2种方法测定4个混合型饲料添加剂样品中胆汁酸的含量,如表4所示。结果表明,4个样品中3种胆汁酸含量,HPLC-RID法均较HPLC-FLD法高。

表4 混合型饲料添加剂中3种胆汁酸含量测定结果

2.4 HPLC法与重量法、容量法的比较

目前,国内外针对混合型饲料添加剂中胆汁酸含量检测方法并不多,目前各饲料添加剂生产企业检测胆汁酸含量的方法主要有重量法和容量法。试验采用HPLC-RID法、HPLC-FLD法、重量法、容量法对4个混合型饲料添加剂胆汁酸样品进行胆汁酸总含量的测定,如表5所示。容量法胆汁酸总含量测定结果最高,重量法次之,而HPLC-RID法和HPLC-FLD法相对偏低。

表5 4种方法混合型饲料添加剂中胆汁酸总含量测定结果

3 讨 论

3.1 前处理条件的选择与优化

胆汁酸含量的检测可以通过HPLC各种检测器实现[24-28],但该技术在分离复杂的胆汁酸化合物方面仍具有一定的局限性。天然存在的胆汁酸既没有紫外吸收,也没有荧光特性,因此可以使用通用型的示差折光检测器,利用折射率的变化对胆汁酸含量进行测定。本试验直接以流动相作为提取液,通过对比不同提取时间、不同提取温度来确定胆汁酸的提取条件,最终确定HPLC-RID法的提取时间为30min、提取温度为30℃,方法简便、易操作,方法重复性、再现性好。

与示差折光检测器相比,荧光检测器对于化合物的含量测定具有更高的灵敏度,因此本试验采用衍生剂进行荧光标记。常用的试剂一般是香豆素类衍生物,如本试验使用的4-溴甲基-7-甲氧基香豆素,同时一般以18-冠醚-6作为相转移催化剂,即本试验使用的1,4,7,10,13,16-六氧杂环十八烷。先以氢氧化钾与胆汁酸皂化生成胆汁酸钾盐,因皂化反应进行较快,因此混匀后反应时间10 min左右即可;皂化后,胆汁酸钾盐的钾离子与1,4,7,10,13,16-六氧杂环十八烷络合,络合物再与4-溴甲基-7-甲氧基香豆素衍生化反应得到胆汁酸荧光衍生物。其中,衍生条件的影响较大,参照前人研究[29]对衍生时间、衍生温度进行考察优化,得到上述HPLC-FLD法衍生最优条件。

3.2 色谱条件的选择与优化

对于通用型的示差折光检测器,因为不同比例流动相的密度以及折光系数不同,改变流动相比例会引起基线的持续变化,因此需要对流动相比例进行比较研究,结果发现,当有机相比例增高时,保留时间减小;同时,示差折光检测器是对温度要求最高的检测器,对温度变化较为敏感,因此需要对柱温箱温度条件进行探索比较,一般室温条件峰形较差,响应值较低,40 ℃最佳。参考前人[30]研究,高效液相色谱-荧光检测器检测胆汁酸含量时,多使用不同比例有机相与水进行梯度洗脱。本试验发现,对于预混料样品中的胆汁酸含量,使用有机相-水作为流动相进行梯度洗脱时,3种胆汁酸分离效果较差,峰形较为难看,因此,为增强其分离效果,改善其峰形,试验使用三氟乙酸调节流动相pH来有效克服峰展宽和拖尾问题。经方法学考察,在上述优化的HPLC-RID和HPLC-FLD法样品前处理、液相色谱条件下,所建立的HPLC-RID和HPLC-FLD法的选择性、线性范围、定量限、正确度、精密度等方法特性参数基本能满足混合型饲料添加剂胆汁酸含量检测需要。

3.3 不同测定方法结果的比较

3.3.1 HPLC-RID法和HPLC-FLD法

采用HPLC-RID和HPLC-FLD 2种方法测定样品中3种胆汁酸含量测定结果,HPLC-RID法均较HPLC-FLD法高,这可能是由于HPLC-FLD法前处理较复杂,需要皂化、衍生后进行HPLC测定,皂化、衍生过程易产生损失,方法回收率、重复性均较HPLC-RID法低,使其最终总含量略低于HPLC-RID法。经过多次试验发现,HPLC-RID法和HPLC-FLD法检测3种胆汁酸的定量限相差数倍,这是基于检测器本身引起的差异,示差折光检测器的检测基于被分析物的折光指数的差异,即测量样品流路与参比流路在折光指数上的差别,其灵敏度较低、选择性较差,对流速、温度及黏度的变化敏感;而荧光检测器是一种高灵敏的选择性检测器,它适用于检测物质本身具有荧光或为了提高灵敏度将没有荧光的物质衍生成荧光衍生物;由于饲料添加剂胆汁酸含量较高,RID的检出限、线性范围均可以满足混合型饲料添加剂胆汁酸主成分含量的检测需要。另外,试验发现,HPLC-FLD法容易受混合型饲料添加剂载体影响,因为混合型饲料添加剂胆汁酸产品大多会使用麦饭石、糠、淀粉等作为载体,每家生产企业配方可能不一样,HPLC-FLD法衍生过程中易受载体基质等影响,造成胆汁酸衍生反应不稳定、衍生效果不稳定,最终导致3种胆汁酸响应值不稳定,特别容易引起批间测定结果差别大,方法重复性和再现性差;HPLC-RID法前处理非常简单,仅需要用流动相提取后直接进行HPLC分析,方法稳定性好,非常适合混合型饲料添加剂中的猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸含量的测定。

3.3.2 HPLC-RID法、HPLC-FLD法、重量法和容量法之间的比较

采用HPLC-RID法、HPLC-FLD法、重量法、容量法对混合型饲料添加剂胆汁酸样品进行胆汁酸总含量的测定,容量法胆汁酸总含量测定结果最高,重量法次之,而HPLC-RID法和HPLC-FLD法相对偏低。这主要是因为4种方法的原理不同,重量法用乙醇-氢氧化钠水解试样、乙醚提取所有胆汁酸,回收乙醚后干燥,重量法得到混合型饲料添加剂胆汁酸产品的总胆汁酸含量,因各混合型饲料添加剂胆汁酸产品原料来源不一,生产工艺差异大,混合型饲料添加剂胆汁酸产品除含有《饲料添加剂品种目录》规定的猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸外,还可能含有胆酸、去氧胆酸、石胆酸等10多种胆汁酸;而容量法用氢氧化钠标准溶液滴定,滴定过程会中和混合型饲料添加剂胆汁酸产品中所有无机酸和有机酸,含量最高;HPLC-RID法、HPLC-FLD法可对猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸等3种胆汁酸进行准确定性定量分析,仅测定这3种胆汁酸的总含量。混合型饲料添加剂胆汁酸生产企业、饲料企业可根据自身实验室条件和检测需要选择适宜的胆汁酸含量测定方法。

4 结 论

① 若针对混合型饲料添加剂胆汁酸产品中猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的含量进行检测,HPLC-RID法和HPLC-FLD法均可准确测定。但HPLC-FLD法测定结果重复性和再现性差,建议选择前处理更简单、稳定性好的HPLC-RID法测定混合型饲料添加剂胆汁酸产品中猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸含量。

② 若针对混合型饲料添加剂胆汁酸产品中的所有胆汁酸的总含量检测,由于容量法滴定中和产品中所有的无机酸和有机酸,测定结果不能正确反映产品中所有胆汁酸的总含量,建议采用《中华人民共和国药典(2015年版一部)》规定的重量法(猪胆粉法)测定混合型饲料添加剂胆汁酸产品中的胆汁酸总含量。