同时蒸馏萃取结合气相色谱-质谱联用解析不同酿酒原料蒸煮香气成分

马浩,明红梅*,郑佳,杨康卓,胥佳,陈法君,黄俊秋

1(四川轻化工大学 生物工程学院,四川 宜宾,644000)

2(宜宾五粮液股份有限公司,四川 宜宾,644000)

中国白酒是世界六大蒸馏酒之一,具有悠久的历史与独特的风味[1]。中国白酒被划分成十二种香型,其中浓香型白酒以其产品的高市场占有率[2],在白酒产业中占有举足轻重的地位。浓香型白酒是以粮谷为原料,采用中温大曲为糖化发酵剂,经泥窖固态发酵、蒸馏,陈酿、勾调而成的蒸馏酒[3]。“混蒸混烧,续糟配料”是五粮浓香型白酒的重要工艺特点,有别于清蒸混烧先蒸酒后配粮的工艺特点,混蒸混烧先将原料与出窖糟醅按一定比例拌合,然后进行上甑、蒸酒,可以达到同时进行取酒和蒸料的目的[4]。通过混蒸混烧,可以将粮食蒸煮的部分香气带入酒体当中,丰富酒体当中的粮食香[5]。

白酒酿造过程中常用的原料有高粱、大米、玉米、糯米、小麦,人们通过长期的生产实践总结出“高粱香、大米净、小麦冲、糯米醇、玉米甜”这一规律[6],因此,不同粮食可以为酒体带来不同的香气特征。随着人们对于白酒品质认识的不断加深,酿造原料的重要性越来越受到人们的重视,科技工作者由此对粮食的香气展开了许多研究,吴幼茹等[7]采用固相微萃取和气相色谱-嗅闻-质谱联用法从高粱、大米、糯米、小麦、玉米蒸煮香气中分别嗅闻到26、20、20、15、10种香气物质,其中己酸乙酯、β-苯乙醇、壬醛、反-2-辛烯醛、糠醛、2-戊基呋喃是重要的香气活性物质;彭智辅等[8]利用香气提取稀释法比较分析了五粮粉经一次蒸煮与二次蒸煮后所收集的清蒸馏液中香气活性成分的差异,发现一次蒸煮馏液中最重要的香气活性成分包括2-甲基丁醛、己醛、(E)-2-庚烯醛、苯乙醛、愈创木酚、邻甲酚、对甲酚、己酸乙酯、二甲基三硫醚和β-大马酮,二次蒸煮馏液中最重要的香气活性成分包括2-甲基丙醛、(E)-2-庚烯醛、二甲基三硫醚、愈创木酚;倪德让等[9]采用浸入式固相微萃取结合气相色谱-嗅闻/质谱联用技术分析蒸煮高粱产生的蒸汽中的风味物质,发现茅台酒酿造用高粱的香气物质以芳香族化合物为主,其中苯乙醛对甜香和花香的贡献最大,1-辛醇、2-戊基呋喃和壬醛为高粱蒸煮香气赋予了青草香,愈创木酚和γ-壬内酯是高粱蒸煮香气中粮食蒸煮香味的主要成因物质。虽然有许多文献对粮食蒸煮香气进行了研究,但粮食蒸煮香气是什么还尚无定论,需要进一步的研究。同时在混蒸混烧过程中,粮食蒸煮香气对酒香的影响相关的研究很少,还需要进一步探究。

随着技术的进步,对于粮食蒸煮风味的分析方法也在不断进步,同时蒸馏萃取(simultaneous distillation extraction,SDE)是一种将水蒸气蒸馏与溶剂萃取相结合,将挥发性成分的提取与溶剂萃取相结合,通过少量溶剂提取大量样品的浓缩方法,具有操作简便且重复性好的优点[10],该前处理方法十分适用于蒸煮香气的分析。廖鹏飞等[5]采用同时蒸馏萃取结合气相色谱-质谱在高粱、小麦、玉米、糯米、大米5种单粮样品蒸煮香气中分别鉴定出108、93、93、66、66种化合物。通过双柱定性,在按生产比例制备的混合粮食样品的蒸煮香气中共鉴定出140种化合物;彭智辅等[11]采用SDE法和固相微萃取法研究五粮液酿酒用大米和糯米的挥发性香气成分,在大米中检出101种香气成分物质;在糯米中检出76种香气成分物质;谢正敏等[12]结合SDE法和固相微萃取法在五粮液酿酒玉米的挥发性香气成分中检出99种组分。

本研究通过SDE结合GC-MS技术对原料的蒸煮香气及原料与酒醅的混蒸香气进行解析,结合香气活度值(odor activity value,OAV) 分析,确定不同原料的重要蒸煮香气及其在混蒸混烧的工艺过程中对酒香的影响,为指导白酒蒸煮工艺的改进及白酒品质的提升提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯红高粱产自四川,糯米、小麦分别产自山东、云南。大米和玉米产自东北,酒醅采集于四川宜宾某酒厂,来源于五粮浓香型跑窖工艺的窖池。

C7～C30正构烷烃标准品(色谱纯),北京百灵威科技有限公司;2-辛醇(色谱纯)、乙酸正戊酯(色谱纯)、2-乙基丁酸(色谱纯)、二氯甲烷(色谱纯),天津市光复精细化工研究所;二氯甲烷(分析纯)、无水硫酸钠(分析纯),成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

BJ800-A多功能粉碎机,德清拜杰电器有限公司;7890A-5975B气相色谱质谱联用仪(GC-MS),美国安捷伦公司;电子恒温水浴锅,北京中兴伟业仪器有限公司;电子调温电热套,北京市永光明医疗仪器厂;L-148全自动氮吹仪,北京来亨科贸有限责任公司;同时蒸馏萃取装置、韦氏分馏柱(24/24),四川华玻玻璃股份有限公司;圆底烧瓶(500 mL)、分液漏斗(500 mL),四川蜀玻有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

粮食的粉碎度:参考陈彬等[13]的方法,高粱、小麦和玉米每颗粮食破碎成4～6瓣,大米、糯米不粉碎。

粮食分组及处理:粮食分组设置GN1、XM1、YM1、NM1、DM1、WL1共6组样本(每组设置平行),GN1、XM1、YM1、NM1、DM1、WL1组分别称取50 g粉碎后的高粱、小麦、玉米、糯米、大米或五粮粉[m(高粱)∶m(小麦)∶m(玉米)∶m(糯米)∶m(大米)=8∶3∶1∶4∶4]置于500 mL圆底烧瓶中,并加入100 mL去离子水,水浴加热1 h后置于同时蒸馏萃取装置轻相端。

混蒸分组及处理:混蒸分组设置GN2、XM2、YM2、NM2、DM2、WL2共6组样本(每组设置平行),GN2、XM2、YM2、NM2、DM2、WL2组分别称取12.5 g粉碎后的高粱、小麦、玉米、糯米、大米和五粮粉[m(高粱)∶m(小麦)∶m(玉米)∶m(糯米)∶m(大米)=8∶3∶1∶4∶4]置于500 mL圆底烧瓶中,添加100 mL去离子水,水浴加热1 h,再加入50 g酒醅、12.5 g熟糠后置于同时蒸馏萃取装置轻相端,同时设置只添加酒醅与熟糠的酒醅对照组ZK作为对照。

采用电热套加热同时蒸馏萃取装置的轻相一端,控制加热至微沸;与此同时,量取100 mL色谱纯二氯甲烷置于500 mL的圆底烧瓶中,加入少量沸石,置于同时蒸馏萃取装置的重相一端,采用水浴加热,控制温度为(48±1) ℃。连续提取1.5 h,萃取液加入适量干燥的无水硫酸钠,置于冰箱中冷冻脱水,过滤,所得滤液用韦氏分馏浓缩装置浓缩后,氮吹至990 μL,密封后置于冰箱中冷藏保存,待进样分析。

1.3.2 风味物质分析条件

GC条件:DB-WAX色谱柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);升温程序:初始40 ℃,保持1 min,以3 ℃/min 升至150 ℃,保持4 min;再以7 ℃/min 升至220 ℃,保持2 min;再以10 ℃/min升至230 ℃,保持5 min;进样口温度:250 ℃;柱流速:恒流1.0 mL/min;分流模式:不分流。

MS条件:电子电离源;离子源温度:230 ℃;四极杆温度:150 ℃;溶剂延迟3 min;数据采集模式:全扫描;质量扫描范围:20～550 au。

1.3.3 定性定量分析方法

定性方法:采用NIST05a.L谱库检索并结合保留指数进行定性分析。

定量方法:采用内标法进行半定量,利用待测物质与内标物质的峰面积比例计算待测物质含量,以各组平行的均值作为最终含量。在待测液中加入10 μL三内标混合溶液(2-辛醇的终浓度为2.83 mg/L、乙酸正戊酯的终质量浓度为2.79 mg/L、2-乙基丁酸的终质量浓度为2.48 mg/L),加盖密封,备用、待测。

1.4 数据分析

采用Excel 2020对数据进行处理,采用Origin 2021绘制堆积柱状图,采用TBtools绘制风味热图,利用美吉生物云平台绘制Venn图。

2 结果与分析

2.1 不同原料蒸煮风味构成特征分析

通过SDE结合GC-MS对高粱、大米、玉米、糯米、小麦、五粮粉的蒸煮风味进行解析,以找出不同原料蒸煮风味的特征。结合文献[14-15],从所有样本中共鉴定出35种香气物质,其中酯类物质10种、醇类物质6种、酸类物质 2种、醛类物质7种、酮类物质3种、呋喃类5种、吡嗪类物质2种。

为了直观展示不同原料的香气构成,基于半定量结果对不同原料的各类香气物质的百分比含量作堆积柱状图,如图1所示。

图1 不同原料的蒸煮香气构成

由图1可知,不同原料及其配伍的蒸煮香气物质构成具有一定的相似性和差异性。总体来看:GN1、DM1和YM1的蒸煮香气成分结构较为接近,均以酯类物质为主要香气物质,并且含量占比均高于80%,分别达到92.54%、95.13%、82.78%;XM1与WL1的蒸煮香气成分构成也较为相似,蒸煮香气中酯类、醛类、醇类、呋喃类含量占比较高,XM1中分别占51.15%、20.52%、11.58%、12.98%,WL1中分别占23.29%、34.19%、20.49%、13.28%;在NM1的蒸煮香气物质中醛类、醇类物质和酮类物质的百分含量占比较高,分别占 65.06%、15.28%和10.76%。

2.2 不同原料蒸煮特征香气物质对比分析及重要香气物质的解析

为了更直观地表现不同单粮蒸煮香气物质之间的种类特征,对GN1、DM1、XM1、YM1、NM1之间的共有或独有的香气物质种类进行叠加,得到香气物质分布的Venn图,如图2所示。结果表明,5种单粮中共确定32种蒸煮香气物质,其中所有单粮共有的蒸煮香气物质仅有3种,分别为2-正戊基呋喃、己醛、1-戊醇,说明5种单粮之间的蒸煮香气物质种类有较大的差异性,其中NM1中独有的蒸煮香气物质种类数最多,达到11种,高粱和小麦独有的蒸煮香气物质种类数分别也达到6种和4种,它们的蒸煮香气物质种类与其他粮食差异性相对较大。

图2 五种单粮蒸煮香气物质种类的Venn图

为了直观地呈现不同原料的蒸煮香气物质的含量特征,对35种的香气物质的含量进行对数标准化并绘制热图,如图3所示,图中颜色越接近红色表示相对含量越高,颜色越接近蓝色表示相对含量越低。

图3 不同原料的蒸煮香气物质含量热图

由图3可知,对同一种原料的蒸煮香气物质的差异进行比较,结果表明,GN1、DM1和XM1的蒸煮香气中的高含量的蒸煮香气物质为棕榈酸乙酯和油酸乙酯,棕榈酸乙酯含量在3组中均为最高,分别达到7 452.02、3 312.398、834.46 μg/L,油酸乙酯的含量分别达到364.41、1 462.91、355.53 μg/L;在YM1的蒸煮香气中十四酸乙酯含量最高,达到1 496.07 μg/L。在NM1的蒸煮香气中含量较高的香气物质为己醛和1-戊醇,含量分别为997.46、147.50 μg/L,在WL1中蒸煮香气中含量最高的香气物质是糠醛和己醛,含量分别达到723.41、397.25 μg/L。

由图3可知,对不同原料的蒸煮香气物质的差异进行比较,结果表明,2-戊醇、异戊醇,乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸仅在GN1的蒸煮香气中被检出;糠醇、糠醛、2-甲基呋喃和香茅醛仅在DM1的蒸煮香气中检测到;2-乙酰基呋喃、2-己基-1-辛醇、甲酸己酯、戊酸乙酯、丁醛、反-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛、苯甲醛、戊醛、2-庚酮仅在NM1中被检出;2-乙酰基-5-甲基呋喃、2,6-二甲基吡嗪仅在WL1的蒸煮香气中被检测到。对图3中不同原料的共有蒸煮香气物质进行比较,结果表明,1-戊醇和己醛在所有原料的蒸煮香气中均被检出,并且2种香气物质在NM1的蒸煮香气中含量均明显高于其他组。油酸乙酯在DM1、GN1、XM1、WL1中均被检出,并且在DM1组中含量明显高于其他组。

为揭示不同原料蒸煮香气中的重要香气物质,通过计算香气活度值,得出OAV>1的物质,如表1所示。GN1、DM1、XM1、YM1、NM1、WL1中共有9种OAV>1的风味成分,包括酯类物质3种、醛类物质3种、酸类物质1种、醇类物质1 种、呋喃类物质1种。

表1 原料蒸煮香气中OAV>1的香气成分

由表1可知,2-正戊基呋喃在所有单粮的蒸煮香气中OAV均大于1,说明它是5种粮食的重要香气物质。己醛在所有原料的蒸煮香气中OAV均大于1,并在NM1中OAV最高,达到113.48,并远高于在其他粮食蒸煮香气中的OAV,说明己醛主要来源于糯米,这与廖鹏飞等[5]的实验结果相一致;己酸仅在GN1中被发现OAV>1,说明是高粱中的重要香气物质;棕榈酸乙酯在GN1、DM1、YM1和WL1中OAV均大于1,其中高粱和大米的蒸煮香气中OAV较大,分别达到37.26和16.56;十四酸乙酯在玉米、大米和高粱中OAV均大于1,尤其是在YM1中OAV达到83.12,说明其对玉米蒸煮香气影响最大;1-辛烯-3-醇、戊酸乙酯、反-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛在糯米中OAV均大于1,说明均为糯米的重要香气成分。

2.3 粮醅混蒸香气构成特征对比分析

通过SDE结合GC-MS分别对ZK、GN2、DM2、XM2、YM2、NM2、WL2中的蒸煮香气进行解析,以找出不同的粮醅混蒸(即原料与酒醅混蒸)香气的风格差异。结合文献[14-15],在所有样本中共鉴定出79种香气成分,其中醇类物质13种,酯类物质33种,酸类物质16种,醛类物质3种,酮类物质4种,呋喃类物质4种,吡嗪类物质3种,酚类物质3种。基于半定量结果将检出的各类香气味物质的含量百分比作堆积柱状图,如图4所示。

由图4可知,不同粮醅混蒸的香气构成均是以酸类物质、酯类物质和醇类物质为主,其含量占比之和在所有组中均达到98%以上,酸类物质在所有组中百分含量占比最大,且分布比较均匀,均为75%～80%,其中在DM2组中酸类物质含量占比最高,达到79.67%;另外酯类物质在各组中分布也比较均匀,含量占比均为16%～20%,WL2组中酯类物质含量占比最高,达到20.64%。在各混蒸组中的醇类物质含量均比较接近,其中NM2组醇类物质含量最高,达到3.51%,而WL2组中醇类物质含量最低,仅有2.65%。对比分析发现,不同粮醅混蒸香气构成均接近于酒醅对照组ZK中的蒸煮香气,均以酸类物质、酯类物质和醇类物质为主,与2.1节中原料的蒸煮香气构成差异较大,说明原料蒸煮香气对其粮醅混蒸香气的构成影响较小。

2.4 粮醅混蒸的重要香气物质对白酒风味组的影响分析

为了直观地呈现样品中香气物质含量的差异,针对每一种香气物质的含量进行对数标准化并绘制聚类热图,如图5所示,图中颜色越接近红色表示相对含量越高,颜色越接近蓝色表示相对含量越低。

图5 不同粮食和酒醅混蒸香气物质的含量热图

由图5聚类分析可知,GN2、WL2、NM2和ZK被聚为了一类,说明在高粱、五粮粉和糯米与酒醅的混蒸组中来源于酒醅的香气物质可能占据了一定比例,DM2、XM2和YM2被另外聚为一类,说明大米、小麦和玉米3种粮食与酒醅混蒸后的香气较为接近。对图5进行分析可知,粮醅混蒸组和酒醅对照组的蒸煮香气物质的含量具有一定的相似性和差异性,己酸、丁酸、乳酸乙酯、己酸乙酯和正戊酸等风味物质在各粮醅混蒸组与酒醅对照组中含量均比较高,具有一定的相似性,说明混蒸香气中的大部分高含量的香气物质更多的来自酒醅;但是存在其他香气物质如2-正戊基呋喃、2-乙酰基呋喃、庚醇、异戊酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸丙酯、己酸甲酯、丁酸异戊酯、正戊酸异戊酯、3-羟基丙酸、4-甲基戊酸、壬酸、肉豆蔻酸、月桂酸、癸酸、丁醛、己醛、2-丁酮、丙酮、2-庚酮等物质仅被检出于粮醅混蒸组,但在酒醅对照组中ZK中未被检出,其中2-正戊基呋喃、2-乙酰基呋喃、2-戊醇己醛、2-丁酮、丙酮、2-庚酮这几种香气物质在2.2节蒸煮原料的风味中也被检出,说明它们有可能来源于原料的蒸煮香气。

为揭示不同原料与酒醅混蒸香气中的特征香气成分及其对白酒风味组的影响,对2.2节中确定的原料的重要蒸煮香气成分及以上20种与酒醅对照组具有明显差异的香气成分计算香气活度值,得出OAV>1的物质,如表2所示。ZK、GN2、DM2、XM2、YM2、NM2、WL2中共筛选出13种OAV>1的香气成分,包括7种酯类物质、1种醛类物质,4种酸类物质和1种呋喃类物质。

由表2可知,在粮醅混蒸香气中,戊酸乙酯、棕榈酸乙酯、十四酸乙酯、己酸在酒醅对照组ZK中OAV>1,说明这4种蒸煮香气物质对酒醅香气有贡献。同时,结合2.2节中结论,戊酸乙酯在糯米的蒸煮香气和混蒸香气中OAV均大于1,棕榈酸乙酯在高粱和小麦的蒸煮香气和混蒸香气中OAV均大于1,十四酸乙酯在高粱、大米和玉米的蒸煮香气和混蒸香气中OAV均大于1,己酸在高粱的蒸煮香气和混蒸香气中OAV均大于1;说明戊酸乙酯、棕榈酸乙酯、十四酸乙酯、己酸这四种香气物质可能来源于粮食和酒醅,并对粮食的蒸煮香气、酒醅的蒸煮香气和它们的混蒸香气产生影响。

在粮醅混蒸粮食香气中,2-正戊基呋喃、己醛、异戊酸乙酯、丁酸丙酯、己酸甲酯、戊酸异戊酯、4-甲基戊酸、壬酸和肉豆蔻酸这些香气物质均有报道在白酒中被检出[14,18-19],说明这些香气成分可能会影响白酒的风味组。同时,以上所有香气成分均未在酒醅对照组ZK中被检出,其中己醛、异戊酸乙酯、丁酸丙酯、己酸甲酯、戊酸异戊酯、4-甲基戊酸、壬酸和肉豆蔻酸并未在粮食蒸煮香气中被检出,说明这些重要香气物质可能来源于原料与酒醅混蒸产生的香气变化;2-正戊基呋喃在高粱、小麦、玉米、糯米的蒸煮香气和混蒸香气中OAV均大于1,己醛在所有原料中的蒸煮香气和混蒸香气中OAV均大于1,说明2-正戊基呋喃、己醛可能主要来源于原料的蒸煮香气,并进一步影响到白酒风味组。

3 结论与讨论

本研究通过同时蒸馏萃取技术结合 GC-MS解析了原料的蒸煮香气成分及粮醅混蒸香气成分,结合OAV分析,确定了不同原料的重要蒸煮香气及其在混蒸混烧的工艺过程中对酒香的影响,

a)对不同原料的蒸煮香气成分进行解析后,结合文献在所有样本中共确定35种香气物质,其中酯类物质10种、醇类物质6种、酸类物质2种、醛类物质7种、酮类物质3种、呋喃类5种、吡嗪类物质2种。对不同原料的蒸煮香气物质结构进行解析,发现高粱、大米、玉米蒸煮香气成分结构比较接近,均以酯类物质为主要香气物质;小麦和五粮粉的蒸煮香气成分构成也较为相似,酯类、醛类、醇类、呋喃类含量占比较高;糯米中的蒸煮香气物质中醛类、醇类物质和酮类物质的百分含量占比较高。

b)通过不同原料香气物质的对比分析及OAV确定不同原料中9种蒸煮粮食的重要香气物质,包括3种酯类物质、3种醛类物质、1种醇类物质、1种酸类物质、1种呋喃类物质。其中,2-正戊基呋喃与己醛这两种香气物质对5种单粮的蒸煮香气中均有重要贡献,己酸是高粱中的重要香气物质,棕榈酸乙酯在高粱、大米、玉米和五粮组合的蒸煮香气中贡献较大;十四酸乙酯在玉米、大米和高粱的蒸煮香气中贡献较大;1-辛烯-3-醇、戊酸乙酯、反-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛是糯米的重要香气物质。

c)对不同原料与酒醅的混合蒸煮香气成分进行解析,结合文献在所有样本中共鉴定出79种香气成分,其中醇类物质13种,酯类物质33种,酸类物质16种,醛类物质3种,酮类物质4种,呋喃类物质4种,吡嗪类物质3种,酚类物质3种。对不同组的混合蒸煮香气物质结构进行解析,不同原料与酒醅混合蒸煮香气构成均接近于酒醅的蒸煮香气,均以酸类物质、酯类物质和醇类物质为主,与原料的蒸煮香气构成差异较大,说明原料蒸煮香气对混蒸香气的构成影响较小。

d)粮醅混蒸香气中戊酸乙酯、棕榈酸乙酯、十四酸乙酯、己酸、2-正戊基呋喃、己醛、异戊酸乙酯、丁酸丙酯、己酸甲酯、戊酸异戊酯、4-甲基戊酸、壬酸和肉豆蔻酸是重要的香气物质,它们可能对白酒风味组有影响,其中异戊酸乙酯、丁酸丙酯、己酸甲酯、戊酸异戊酯、4-甲基戊酸、壬酸和肉豆蔻酸,可能主要来源于粮醅混蒸产生的香气变化,2-正戊基呋喃和己醛可能主要来源于原料的蒸煮香气。

本研究初步确定了不同粮食及其混蒸酒醅的重要蒸煮香气成分,初步探索了混蒸混烧工艺对白酒风味组的影响。但是,因酿酒原料的品种、产地等不同,及原料与酒醅混蒸比例、上甑时间、馏酒速度等因素不同,会进一步影响其蒸煮香气成分。因此,还需结合生产实际,根据生产工艺及白酒产品需求,并进一步优化风味物质解析方法,深入剖析不同酿酒原料的重要蒸煮香气组分,探索蒸煮条件对蒸煮香气物质变化及白酒风味组分的影响等,为优化白酒蒸煮工艺,提升白酒品质提供有益参考。