circ_HIPK3靶向miR-381-3p/ZNF217轴调控Aβ诱导的海马神经元功能和形态

李伟 陈亮 吕昌迎

摘要：目的 分析環状RNA同源结构域相互作用蛋白激酶3（circ_HIPK3）靶向miR-381-3p/锌指蛋白217（ZNF217）轴对β淀粉样蛋白（Aβ）诱导的海马神经元功能和形态的影响。方法 制备新生大鼠海马神经元，分为对照组、Aβ组、si NC1组、si HIPK3组、si HIPK3+inhibitor NC组、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si NC2组、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217组，除对照组外其余组均通过40 μmol/L Aβ1～42诱导。qRT-PCR法测定海马神经元circ_HIPK3、miR-381-3p、ZNF217 mRNA表达，透射电镜观察细胞形态，CCK-8法测定海马神经元存活率，Hochesst 33342法测定海马神经元凋亡，流式细胞仪检测海马神经元内Ca2+荧光强度，Western blot法测定海马神经元磷酸化Tau蛋白（P-Tau）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、ZNF217蛋白表达，双萤光素酶报告基因分析miR-381-3p与circ_HIPK3、ZNF217靶向关系。结果 对照组海马神经元结构正常，胞核形态正常，线粒体、内质网无病理改变；Aβ组海马神经元呈退行性改变，核形态异常，膜内陷，可见大量线粒体肿胀，胞浆内含大量脂滴空泡；与Aβ组相比，si HIPK3组海马神经元结构部分恢复；与si HIPK3组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组海马神经元结构损伤严重；与si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217组海马神经元结构损伤减轻。与对照组相比，Aβ组海马神经元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和蛋白表达、凋亡率、Ca2+荧光强度、P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表达升高，miR-381-3p表达、存活率、Bcl-2蛋白表达降低（P＜0.05）；与Aβ组相比，si HIPK3组海马神经元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和蛋白表达、凋亡率、Ca2+荧光强度、P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表达降低，miR-381-3p表达、存活率、Bcl-2蛋白表达升高（P＜0.05）；与si HIPK3组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组海马神经元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和蛋白表达、凋亡率、Ca2+荧光强度、P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表达升高，miR-381-3p水平、存活率、Bcl-2蛋白表达降低（P＜0.05）；与si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217组海马神经元ZNF217 mRNA和蛋白表达水平、凋亡率、Ca2+荧光强度、P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表达降低，存活率、Bcl-2蛋白表达升高（P＜0.05）；miR-381-3p与circ_HIPK3、ZNF217均靶向结合。结论 circ_HIPK3沉默可能通过调控miR-381-3p/ZNF217轴改善Aβ诱导的海马神经元结构功能损伤。

关键词：海马；神经元；Tristetraprolin蛋白；circ_HIPK3；miR-381-3p；ZNF217

中图分类号：R749.16文献标志码：ADOI：10.11958/20231013

circ_HIPK3 regulates function and morphology of Aβ induced hippocampal neurons by targeting miR-381-3p/ZNF217 axis

LI Wei1， CHEN Liang1， LYU Changying2△

1 Department 1 of Encephalopathy， 2 Department 3 of Encephalopathy， Jinan Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital， Jinan 271100， China

△Corresponding Author E-mail： lvchangying@sohu.com

Abstract： Objective To analyze the influence of cyclic RNA homologous domain interacting protein kinase 3 （circ_HIPK3） on function and morphology of myloid β-protein （Aβ） induced hippocampal neurons by targeting miR-381-3p/zinc finger protein 217 （ZNF217） axis. Methods Hippocampal neurons of neonatal rats were prepared and divided into the control group， the Aβ group， the si NC1 group， the si HIPK3 group， the si HIPK3+inhibitor NC group， the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group， the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si NC2 group and the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217 group. Except the control group， all the other groups were modeled by 40 μmol/L Aβ1～42. qRT-PCR was used to determine the circ of hippocampal neurons circ_HIPK3， miR-381-3p and ZNF217 mRNA levels. Cell morphology was observed by transmission electron microscope， and the survival rate of hippocampal neurons was measured by CCK-8 method. Hochesst 33342 method was used to measure apoptosis of hippocampal neurons. The intracellular Ca2+ fluorescence intensity of hippocampal neurons was detected by flow cytometry. The expression levels of P-Tau， B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl-2-associated X protein （Bax）， Caspase-3 and ZNF217 proteins in hippocampal neurons were measured by Western blot assay. Double luciferase reporter genes were used to analyze the targeting relationship between miR-381-3p and circ_HIPK3， ZNF217. Results In the control group， the structure of hippocampal neurons was normal， the morphology of nucleus was normal， and there were no pathological changes in mitochondria and endoplasmic reticulum. In the Aβ group， hippocampal neurons showed degenerative changes， abnormal nuclear morphology， membrane invagination， a large number of mitochondria swelling and a large number of lipid droplets vacuoles in cytoplasm. Compared with the Aβ group， the hippocampal neuronal structure was partially restored in the si HIPK3 group. Compared with the si HIPK3 group， the hippocampal neuronal structure was severely damaged in the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group. Compared with the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group， the damage of hippocampal neurons in the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217 group was reduced. Compared with the control group， the circ_HIPK3， ZNF217 mRNA and ZNF217 protein levels， apoptosis rate， Ca2+ fluorescence intensity， P-Tau， Bax， Caspase-3 protein expression of hippocampal neurons were increased in the Aβ group， and the miR-381-3p level， survival rate and Bcl-2 protein expression decreased （P＜0.05）. Compared with the Aβ group， the circ_HIPK3， ZNF217 mRNA and ZNF217 protein levels， apoptosis rate， Ca2+ fluorescence intensity， P-Tau， Bax and Caspase-3 protein expression of hippocampal neurons were decreased in the si HIPK3 group， and  miR-381-3p level， survival rate and Bcl-2 protein expression increased （P＜0.05）. Compared with the si HIPK3 group， the circ_HIPK3， ZNF217 mRNA and ZNF217 protein levels， apoptosis rate， Ca2+ fluorescence intensity， P-Tau， Bax and Caspase-3 protein expression of hippocampal neurons in the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group were increased， and the miR-381-3p level， survival rate and Bcl-2 protein expression decreased （P＜0.05）. Compared with the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group， the ZNF217 mRNA and ZNF217 protein levels， apoptosis rate， Ca2+ fluorescence intensity， P-Tau， Bax and Caspase-3 protein expression of hippocampal neurons in the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217 group were decreased， and the survival rate and Bcl-2 protein expression increased （P＜0.05）. miR-381-3p targeted and combined with HIPK3 and ZNF217. Conclusion circ_HIPK3 silencing may ameliorate Aβ-induced damage of hippocampal neuronal structure and function by regulating miR-381-3p/ZNF217 axis.

Key words： hippocampus; neurons; tristetraprolin; circ_HIPK3; miR-381-3p; ZNF217

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是临床上表现为记忆衰退、失语、行为障碍等痴呆行为的神经进展性疾病，随着人口老龄化进程加快，AD发病率呈上升趋势［1-2］。β淀粉样蛋白（Amyloid β-protein，Aβ）是由β-淀粉样前体蛋白水解而来，在脑脊液中大量存在，在细胞基质沉淀聚积后具有很强的神经毒性作用，可刺激海马神经元变性和死亡，被认定为AD发病的因素之一［3］。基于此构建AD损伤细胞模型并进行分子靶向分析是研究AD病理的重要方式。环状RNA（circRNA）在生物体内广泛存在，在各种细胞活动中发挥关键作用，可与miRNA竞争性结合参与对下游靶基因的调控，环状RNA同源结构域相互作用蛋白激酶3（circRNA homologous domain-interacting protein kinase 3，circ_HIPK3）是一种circRNA，可促进神经胶质瘤细胞增殖与转移［4］，减轻CoCl2诱导的神经元凋亡［5］。miR-381-3p在AD患者体内呈低表达，其过表达可减弱Aβ诱导的神经毒性和炎症反应［6］。锌指蛋白217（Zinc finger protein 217，ZNF217）属于锌指基因家族成员之一，与AD发病风险有关联［7］；调节miR-200/ZNF217轴可防止Aβ诱导的PC12细胞神经毒性［8］。经查询StarBase生物信息学网站（https：//rnasysu.com/encori/）发现，miR-381-3p与circ_HIPK3、ZNF217均存在结合位点，circ_HIPK3能否通过miR-381-3p/ZNF217轴参与对Aβ诱导的海马神经元结构与功能造成影响仍未知，本研究将对此进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SPF级新生SD大鼠10只，1日龄，体质量6.0～7.0 g，购自廣东莱迪生物医药研究院有限公司，生产许可证号：SCXK（粤）2022-0064。实验前将其与母鼠饲养于同笼，母鼠均正常喂养，动物饲养温度为22～24 ℃，光照/黑暗时间为12 h，相对湿度40%～60%，大鼠自由摄食、饮水。本实验经济南市中西医结合医院伦理委员会批准［（2022）伦审第（044）号-KY］，在实验过程中按照动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

1.1.2 主要试剂与仪器 CCK-8试剂盒、Hochesst 33342染色液、钙荧光探针fluo-3 AM、TRIzol试剂、Lipo脂质体高效转染试剂购自北京索莱宝生物科技有限公司；cDNA第一链合成/RNA逆转录试剂盒、SYBR Green qPCR Mix（2×）购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗微管相关蛋白2（Microtubule associated protein 2，MAP2）、磷酸化Tau蛋白（P-Tau）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、ZNF217购自英国Abcam公司。Gallios流式细胞仪购自美国贝克曼公司；7500荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；Spectra S/TEM透射电子显微镜购自美国Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海马神经元分离与分组 将新生大鼠断头处死，无菌环境下分离大鼠海马组织并剪碎，胰酶消化，终止消化并吹打细胞后进行过滤初筛，调整细胞浓度（1×106个/mL），接种至L-多聚赖氨酸处理的6孔板，培养箱内培养，48 h后加入5 g/L阿糖胞苷抑制神经元活性，隔3 d换液（1/2原培养基），第5天采用神经元特异性标志物MAP2进行免疫荧光染色鉴定神经元，阳性率高于90%为神经元［9］。

将神经元分为对照组（正常培养）、Aβ组（40 μmol/L Aβ1～42培养48 h［10］）、si NC1组（转染si NC1）、si HIPK3组（转染si HIPK3）、si HIPK3+inhibitor NC组（si HIPK3与inhibitor NC共转染）、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组（si HIPK3与miR-381-3p inhibitor共转染）、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si NC2组（si HIPK3、miR-381-3p inhibitor、si NC2共转染）、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217组（si HIPK3、miR-381-3p inhibitor、si ZNF217共转染）。除对照组外，其余组均采用Lipo转染试剂盒进行转染，转染6 h后细胞加入40 μmol/L Aβ1～42培养48 h。

1.2.2 qRT-PCR法测定海马神经元circ_HIPK3、miR-381-3p、ZNF217 mRNA水平 取各组海马神经元总RNA（TRIzol试剂），并将一定量RNA逆转录为cDNA，进行扩增，测定程序为94 ℃预处理3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 5 min。circ_HIPK3、ZNF217（内参GAPDH）、miR-381-3p（内参U6）水平以2-ΔΔCt法确定。引物序列见表1。

1.2.3 透射电子显微镜观察海马神经元形态 制备细胞涂片：将盖玻片（10 mm×10 mm）在95%乙醇（含1%盐酸）中浸泡过夜，然后用95%乙醇冲洗2次，灭菌备用。将琼脂糖滴在盖玻片上，使盖玻片表面覆盖一层琼脂糖（约20 μm厚），再将多聚赖氨酸（0.01 mol/L硼酸溶解）铺在包被有琼脂糖的盖玻片上，将盖玻片置于无菌条件下的24孔培养板中，加入细胞悬液（1×105个/mL）进行培养。待细胞长至铺满孔底后取出盖玻片，戊二醛预固定30 min后，用细胞刮子轻轻将细胞连同琼脂糖膜刮下，继续用戊二醛2 h，锇酸再次固定，经乙醇丙酮梯度脱水、浸透、包埋等步骤后，制备超薄切片（70 nm），透射电镜观察细胞形态。

1.2.4 CCK-8法测定海马神经元存活率 将各组细胞以每孔4 000个的密度接种到96孔板中，培养48 h后，加入CCK-8试剂，培养箱内继续培养4 h后，使用酶标仪测定各组细胞在450 nm处的光密度（OD）值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.2.5 海马神经元凋亡率测定 胰酶消化细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗并重悬，取1 mL细胞悬液（1×105个/mL）接种至24孔板后，PBS清洗细胞，4%多聚甲醛固定细胞5 min，加入Hochesst 33342染色液孵育5 min，PBS清洗细胞，加入抗荧光淬灭封片液封固，荧光显微镜下观察并确定细胞凋亡情况。

1.2.6 荧光探针fluo-3 AM法检测海马神经元内Ca2+荧光强度 无Ca2+细胞外液（135 mmol/L NaCl、KCl、MgCl2、10 mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸、4 g/L葡萄糖）稀释荧光探针fluo-3 AM（5 μmol/L），分组处理后收集各组细胞（1×105个/mL）至不同管中，加入1 mmol/L fluo-3 AM 5 μL，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤3次，流式细胞仪检测细胞内Ca2+荧光强度（以发出荧光细胞的比例计）。

1.2.7 Western blot检测细胞中P-Tau、Bcl-2、Bax、Caspase-3、ZNF217蛋白表达 提取细胞总蛋白，BCA法检测总蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳分离总蛋白，湿法转模，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗P-Tau、Bcl-2、Bax、Caspase-3、ZNF217（稀释比1∶1 000），4 ℃过夜，洗涤3次，加入山羊抗兔IgG（稀释比1∶5 000），室温下孵育1.5 h，TBST洗涤3次。增强化学发光底物显色，用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白质条带灰度，计算目的蛋白的相对表达水平。实验重复3次，以β-actin作为内参。

1.2.8 双萤光素酶鉴定靶向关系 构建circ_HIPK3和ZNF217的野生型（WT）與突变型（MUT）质粒，分别命名为WT HIPK3、MUT HIPK3、WT ZNF217、MUT ZNF217，将其分别与mimic NC、miR-381-3p mimic共转染，分别作为mimics NC+WT HIPK3组、miR-381-3p mimics+WT HIPK3组、mimics NC+MUT HIPK3组、miR-381-3p mimics+MUT HIPK3组；mimics NC+WT ZNF217组、miR-381-3p mimics+WT ZNF217组、mimics NC+MUT ZNF217组、miR-381-3p mimics+MUT ZNF217组，转染48 h，双萤光素酶试剂盒测定萤光素酶相对活性。检测circ_HIPK3沉默表达对miR-381-3p表达及miR-381-3p过表达对ZNF217 mRNA与蛋白表达的影响。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（[x] ±s）表示，2组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 海马神经元鉴定 海马神经元培养7 d后，荧光显微镜下观察MAP-2蛋白阳性率>90%，见图1。

2.2 各组海马神经元circ_HIPK3、miR-381-3p、ZNF217 mRNA和蛋白表达水平比较 与对照组相比，Aβ组海马神经元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和ZNF217蛋白表达水平升高，miR-381-3p表达水平降低（P＜0.05）；与Aβ组相比，si HIPK3组海马神经元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和ZNF217蛋白表达水平降低，miR-381-3p表达水平升高（P＜0.05）；与si HIPK3组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组海马神经元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和ZNF217蛋白表达水平升高，miR-381-3p表达水平降低（P＜0.05）；与si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217组海马神经元ZNF217 mRNA和ZNF217蛋白表达水平降低（P＜0.05），见图2、表2。

2.3 各组海马神经元形态观察 对照组海马神经元结构正常，胞核形态正常，线粒体、内质网无病理改变；Aβ组海马神经元呈退行性改变，核形态异常，膜内陷，可见大量线粒体肿胀，胞浆内含大量脂滴空泡；与Aβ组相比，si HIPK3组海马神经元结构部分恢复；与si HIPK3组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组海马神经元结构损伤严重；与si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217组海马神经元结构损伤减轻，见图3。

2.4 各组海马神经元活力比较 与对照组相比，Aβ组神经元存活率降低（P＜0.05）；与Aβ组相比，si HIPK3组神经元存活率升高（P＜0.05）；与si HIPK3组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组神经元存活率降低（P＜0.05）；与si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217组神经元存活率升高（P＜0.05），见表3。

2.5 各组海马神经元凋亡比较 对照组神经元凋亡极少，染色极少；与对照组相比，Aβ组海马神经元凋亡率升高，呈现蓝色荧光（P＜0.05）；与Aβ组相比，si HIPK3组海马神经元凋亡率降低（P＜0.05）；与si HIPK3组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组海马神经元凋亡率升高（P＜0.05）；与si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217组海马神经元凋亡率降低（P＜0.05），见图4、表3。

2.6 各组海马神经元Ca2+荧光强度比较 与对照组相比，Aβ组海马神经元Ca2+荧光强度升高（P＜0.05）；与Aβ组相比，si HIPK3组海马神经元Ca2+荧光强度降低（P＜0.05）；与si HIPK3组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组海马神经元Ca2+荧光强度升高（P＜0.05）；与si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217组Ca2+荧光强度降低（P＜0.05），见图5、表3。

2.7 各组海马神经元相关蛋白、凋亡相关蛋白表达比较 与对照组相比，Aβ组海马神经元P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与Aβ组相比，si HIPK3组海马神经元P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低，Bcl-2蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与si HIPK3组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组海马神经元P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与si HIPK3+miR-381-3p inhibitor组相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217组海马神经元P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低，Bcl-2蛋白表达水平升高（P＜0.05），见表4、图6。

2.8 靶向关系结果 miR-381-3p与circ_HIPK3、ZNF217均具有结合位点，见图7。双萤光素酶显示，miR-381-3p mimics+WT HIPK3组萤光素酶活性低于mimics NC+WT HIPK3组（P＜0.05），miR-381-3p mimics+MUT HIPK3组与mimics NC+MUT HIPK3组萤光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）；miR-128-3p mimics+WT ZNF217组萤光素酶活性低于mimics NC+WT ZNF217组（P＜0.05），miR-128-3p mimics+MUT ZNF217组萤光素酶活性与mimics NC+MUT ZNF217组差异无统计学意义，见表5。

与sh NC组相比，sh HIPK3组miR-381-3p表达水平升高（1.41±0.13 vs. 0.82±0.08，t=9.468，P＜0.05）；与mimics NC组相比，miR-381-3p mimics组ZNF217 mRNA（0.46±0.04 vs. 1.06±0.17，t=8.415，P＜0.05）与蛋白降低（0.33±0.04 vs. 0.83±0.09，t=12.435，P＜0.05），见图8。

3 讨论

海马神经元结构、功能损伤是AD发病基础之一［11］，控制海马神经元凋亡是延缓AD发展的方式。Aβ诱导学说是目前主流观点之一，神经外Aβ沉积诱导神经衰老、细胞凋亡和炎症反应。本研究通过构建Aβ诱导大鼠海马神经元，构建海马神经元损伤模型，探讨AD相关分子机制。

circ_HIPK3在非小细胞肺癌细胞［12］、结直肠癌［13］凋亡的调控中发挥重要作用。Zhao等［14］研究显示，circ_HIPK3可通过竞争性内源性RNA（ceRNA）模式减轻脊髓损伤中神经元凋亡。有报道称，敲低HIPK3可通过增强自噬，降低HTT蛋白表达水平，改善亨廷顿病小鼠神经损伤［15］。在本研究中，Aβ诱导的海马神经元呈退行性改变，核形态异常，膜内陷，可见大量线粒体肿胀，胞浆内含大量脂滴空泡，且细胞存活率降低，凋亡率增高，并伴随Bcl-2蛋白表达水平降低及Bax蛋白表达水平升高，证明模型构建成功。采用小分子干扰技术敲低circ_HIPK3后，Aβ诱导的海马神经元形态有所恢复，细胞存活率升高，凋亡率降低，Bcl-2蛋白表达水平升高及Bax蛋白表达水平降低，提示沉默circ_HIPK3可对AD神经元损伤发挥保护作用。Ca2+可维持神经细胞正常功能，Aβ沉积会引起神经元Ca2+超载，激活一系列级联反应，在AD发生发展中发挥作用［16］。本研究中沉默circ_HIPK3可降低Aβ诱导的海马神经元Ca2+超载，表现为Ca2+荧光强度降低，推测其可能原因是沉默circ_HIPK3可抑制细胞膜上Ca2+通道，使Ca2+内流减少，改善Ca2+超载现象。此外，神经元相关蛋白P-Tau蛋白表达水平降低亦证明沉默circ_HIPK3可发挥神经元保护作用。

CircRNA可通过海绵化吸附miRNA調控下游靶基因表达发挥作用。miRNA是一种高度稳定、小而短的非编码RNA分子，参与细胞生长、代谢、分化和发育的调节。miR-381-3p是近年来新发现的一种miRNA。在AD患者血清和细胞模型中检测到miR-381-3p低表达，过表达miR-381-3p可减弱Aβ诱导的神经毒性和炎症反应［6］。本研究中Aβ诱导的海马神经元中miR-381-3p表达水平降低，与既往研究结果［6］一致；沉默circ_HIPK3可上调Aβ诱导的海马神经元中miR-381-3p表达，且miR-381-3p与circ_HIPK3存在互补的结合位点；推测沉默circ_HIPK3对Aβ诱导的海马神经元损伤的改善作用可能与miR-381-3p表达有关。本研究采用双萤光素酶实验证实miR-381-3p与circ_HIPK3之间存在靶向结合关系，miR-381-3p低表达可逆转circ_HIPK3沉默对海马神经元的保护作用，提示circ_HIPK3沉默可能通过上调miR-381-3p表达对Aβ诱导的海马神经元发挥保护作用。

ZNF217定位于人染色体20q 13.2，表达产物为ZNF217蛋白。Wu等［17］研究显示，ZNF217在AD中参与Aβ诱导的神经元损伤。lncRNA SNHG1敲除可通过上调miR-361-3p表达，降低ZNF217表达，减轻神经元损伤［18］。本研究结果显示，Aβ诱导的海马神经元中ZNF217 mRNA和蛋白表达水平升高，与miR-381-3p表达趋势相反；miR-381-3p与ZNF217存在结合位点，双萤光素酶实验亦验证了miR-381-3p与ZNF217之间存在靶向结合关系，且miR-381-3p过表达后ZNF217 mRNA和蛋白表达水平降低，miR-381-3p低表达可逆转circ_HIPK3沉默对海马神经元的保护作用，而此逆转作用又可被ZNF217沉默恢复，即ZNF217沉默亦可发挥对海马神经元的保护作用，提示circ_HIPK3沉默可能通过上调miR-381-3p表达，抑制ZNF217表达发挥对海马神经元的保护作用。

综上所述，沉默circ_HIPK3可能通过调控miR-381-3p/ZNF217轴改善Aβ诱导的海马神经元结构功能损伤。后续将在动物模型中对本研究结果进行验证，此外，circRNA可调控的下游靶miRNA众多，circ_HIPK3能否通过其他分子通路發挥作用仍有待进一步探究。

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（2023-07-27收稿 2023-09-18修回）

（本文编辑 陈丽洁）