高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测

2024-04-01张力超

吉林畜牧兽医 2024年2期

张力超

磐石市动物检疫站，吉林磐石 132300

近年来，随着人们生活水平的提高，大家对猪肉的需求和猪肉的品质要求也越来越高，很多人开始加入高标准生猪养殖的队伍，生猪养殖的数量和规模在不断地扩大。但同时各种疾病也随之而来，其中，猪蓝耳病是生猪养殖的主要疫病之一，这种病对生猪的危害极大，传染性很强，一旦发病，很容易造成大面积传播，猪死亡数量增加，这样就会导致经济效益降低。

1 猪蓝耳病的概念

猪蓝耳病，也被称为猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)，它属于一种危害很大、流行范围很广的传染病，不同年龄、品种和性别的猪都可以被感染，在临床上，它的症状主要有：怀孕母猪流产、早产、木乃伊胎和死胎繁殖障碍，仔猪和育肥猪出现呼吸道综合症状[1～3]，它属于一种免疫抑制病，经常会继发其他病原感染。

2 国内外猪蓝耳病现状

猪蓝耳病距今已经有三十多年的历史，第一次于1987年被美国报道，1990～1991年在欧洲暴发，导致超过一百万头猪死亡[4～6]。在1991年，荷兰的wenswon等人首先从病猪身上提取到了这种病毒。自20世纪90年代初首次发现于亚洲地区后[7～8]，至2006年已在中国10余个省份检出，累计已达20万余头，近50头猪死亡[9]。该病的主要特点为：在我国该病的发病率高达100%，死亡率高达50%，母猪的流产率高达30%[10]，而且在育肥过程中还会出现病死症。高致病力猪蓝耳病毒（Virus）具有传染性强、传播迅速、发病率高、病死率高等特点，在世界范围内广泛流行，给我国生猪产业带来了极大地危害。

3 研究目的和意义

高致病猪蓝耳病是一种严重危害猪群健康的疾病，但其发病机制尚不明确。另外，由于与其他导致母猪生殖障碍综合征的疾病具有十分相似的临床表现，并且PRRS生猪的不同种群和不同的发病时期表现出较大的差别，再加上近年来逐渐增多的亚临床型和慢性感染，使得该病的确诊变得更加困难。所以，从病猪的临床表现和病理改变来看，都不能明确诊断，还需要通过实验室检测来明确诊断。而常用的实验室诊断有以下几种方法：①反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)；②酶联免疫吸附试验法（ELISA)；③免疫过氧化物酶单层细胞染色试验法（IPMA)；④血清中和试验（SN)；⑤间接免疫荧光试验法（简称IFA）。然而，现有的检测手段或缺乏特异性或灵敏度低，或操作繁琐费时费力，无法实现对PRRSV和HP-PRRSV的快速识别。用RT-PCR方法检测高致病性猪蓝耳病时,操作较为简便,对临床样品的快速诊断及流行病学调查具有很强的实用价值。

4 材料与方法

4.1 材料

4.1.1 主要试剂

RNA抽提试，PCR试剂。

4.1.2 主要仪器

紫外可见光光度计，超净工作台，PCR仪，高速低温离心机，电子天平，冰箱。

4.1.3 病料

病料采集自本地部分地区具有猪蓝耳病临床症状和病理变化的病猪、死猪。

4.2 方法

4.2.1 样品的采集和处理

称量取猪组织0.05g（肺，脑，扁桃体，脾），置于粉碎机中，用微量的石英砂进行粉碎机粉碎，然后用1.5mL的生理盐水继续进行粉碎，搅拌均匀后，转移到1.5mL无菌离心管内，以8000r/s的速度离心8min，将100µL的上清液置于1.5mL的EP试管内。

阳性对照组：将100µL的阳性对照组置于1.5mL的EP试管内。

阴性对照组：将100µL的阴性对照组置于1.5mL的EP试管内。

4.2.2 病毒RNA的提取

将200mg的组织取出，放入1.5mL的EP管中，再将1mL的TRIZOL试剂倒入其中，进行匀浆处理。震动30s，在室温静置6min,然后添加0.2mL氯仿，猛烈摇晃30s，混合均匀，在12000r/s和4℃下，在5min的室温静置15min,把上清移到一个新的离心机中，再加同上清量相同的异丙醇，倒置搅拌均匀。在-20℃下放置30min，在12000r/s下，在4℃下进行20min的离心，除去上清液。之后将75%乙醇1mL加到该沉淀物上，以12000r/s的速度在4℃下进行10min的离心。去掉上层清液，使其保持沉降，然后晾干10min。将所得到的沉淀物溶于20µLDEPC处理过的水中，并将其置于-20℃的环境中。

4.2.3 进行RT-PCR

4.2.3.1 cDNA的制备

以上一步骤获取的RNA作为模板，按照实验室设定的反转录条件，制备10µL反向录体系，在PCR仪上进行反转录，在30℃退火，42℃延长，99℃变性反应后，得到cDNA。在这里，反向记录条件被描述如下。

当反应条件为30℃时，作用时间10min，当反应条件为42℃时，作用时间60min，当反应条件99℃时，作用时间5min，当反应条件为4℃时，作用时间60min，然后停止。

4.2.3.2 PCR扩增

以反转录产物cDNA作为模板，通过上下游引物（P1/P2）对目标基因进行PCR，然后加入Taq脱氧核酶，将dNTP放入PCR反应管内，最终与ddH20进行配平。接着将PCR反应试条放入PCR放大器内，进行预变、变、退火、伸展、全伸展等反应，并进行35次以上的循环，最后将PCR结果储存在4℃下。组分为10xbuffer时，反应体积2.5µL，组分为TaqDNA酶时，反应体积0.5µL，当组分为dNTPmixture时，反应体积2.0µL，当组分为P1时，反应体积1.0µL，当组分为P2时，反应体积1.0µL，当组分为cDNA时，反应体积2.0µL，当组分为ddH20时，反应体积16µL。

反应条件。Pcr扩增条件，当反应条件为94℃预变性，作用时间为5min，当反应条件94℃变性，作用时间30s，当反应条件65℃退火，作用时间30s，当反应条件72℃延伸，作用时间30s，如此做35次循环，当反应条件72℃总延伸，作用时间7min，4℃保存。

4.2.4 电泳

4.2.4.1 制备2.0%琼脂糖凝胶板

准备2%的琼脂糖（20mL的小橡胶）：在一个圆筒中，将0.4g的琼脂糖置于其中，再加20mL1xTAE，将小烧杯倒转过来，在微波炉中加热三次，直到所有的琼脂糖都溶解掉，然后把电泳槽关闭，再加一把梳子，把它放到大约65℃的温度下搅拌，然后把它仔细地倒进一个内槽玻璃板里，让它慢慢地扩散，一直扩散到玻璃凹陷里，在室温和温下静置，直到它彻底凝结，垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中，再把1xTAE的凹陷进去，一直到它淹没在凹陷里1～2mm。

4.2.4.2 加样

将5µLPCR反应的结果和0.5µL的加样缓冲剂混合后，放入琼脂糖胶片上的加样口，用10µL微型吸液器把试样放入胶片上的试样凹陷处，每次放入一个试样后，要重新放入试样，避免污染，放入试样时要注意记录好放入的次序。

4.2.4.3 电泳

将凝胶板放入后，立刻对试片上的凝胶板进行电流电泳，将电泳器上的盖子和电极插入，在120伏的电压下，电泳26min，试片从负极（黑）到正极（红），直到BPA显示的条条游走到2/3的位置，才结束电泳（以DNA分子量为基准进行电泳）。

4.2.4.4 染胶

在完成电泳后将所述凝胶移除，以0.5µg/mL的1xTAEBrylar为1xTAE，对其进行大约18min的染色，然后用水冲洗9min.

4.2.4.5 观察照相

将所制备的凝集素置于长波长紫外线灯胶体成像机和紫外线透光机上，对其进行紫外透射仪观察和记录。

4.2.4.6 判断片段大小

用分子量标准比较判断PCR片段大小。

5 结果与讨论

5.1 阳性、阴性对照检测结果

当阳性对照显示421bpHP-PRRSV/511bp美国型扩增带时，阴性对照没有对应的靶带，该次检测成立，并判定结果。

5.2 待检样品检测结果

待检样品RT-PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳后，在紫外分析仪下出现了目的性扩增条带，说明该养猪场有高致病性猪蓝耳病流行，且病毒呈阳性。

5.3 讨论

5.3.1 RT—PCR结果判定的影响因素

5.3.1.1 混合感染的影响

在各地表现出相似的临床表现，只不过是因为病毒的变异而产生的。由于在中国暴发了这场疫情，在各个地方都会出现不一样的病理学特征，有些是单一的病毒感染，有些是多种的细菌组合感染，在进行了细菌学的检测之后，没有发现任何由其他细菌导致的并发症。

5.3.1.2 操作过程中的影响

在进行RT-PCR检测时其中最重要的一步，就是抽取RNA。用变性试剂将组织或细胞粉碎，再用氯仿等有机溶剂提取，再进行沉淀、洗涤、干燥，最终溶解。RNase普遍且稳定性好，能抵抗高压灭菌、煮沸等环境条件，且通常无需辅酶。因此，在RNA制剂中，哪怕是有一点点的RNA酶，都会导致RNA在生产与分析的过程中发生分解，而所生产的RNA的完整性和纯度，则会对RNA分析的结果产生直接地影响，因此，RNA的生产与分析的操作具有很大的难度。试验中要注意的问题有很多，一是要尽量减少内源RNase；此外，还需对外来核酸酶进行严格地控制。在操作者的手汗、唾液等中发现了一种外来的核酸酶，它还可以在粉尘中发现，用于其他分子生物试验的核酸酶也可能引起污染。

5.3.2 如何做好高致病性猪蓝耳病防治工作

预防高致病性猪蓝耳病必须从推广科学饲喂、改进饲喂条件、强化综合性防治、实施有效的疫苗接种等方面进行探讨。要做好以下工作。

5.3.2.1 强化饲养的管理

采取“全进全出”的饲养方式，夏季要做好防热、防风的工作，冬季则要兼顾室内的温度和空气流通。大型场一定要对其进行封闭式的管理。

5.3.2.2 科学免疫

一般情况，育肥猪在24日龄左右，接种一次高致病性猪蓝耳病疫苗，种母猪除了24日龄左右进行免疫外，配种前应加强一次免疫，种公猪除了在24日龄左右免疫外，间隔6个月也要进行一次免疫。

5.3.2.3 规范补栏

在购买仔猪的时候，要尽量挑选没有发生疾病的地区，并且要检查是否有检验合格的检验报告，买回来之后先进行半个月的隔离，待体温恢复正常后，才可以进行混群。

5.3.2.4 加强消毒工作

做好养猪场的环境卫生工作，用复合醛类等消毒剂给养殖场、猪舍和周边环境消毒，养猪场的粪便要及时清理干净。

5.3.2.5 药物预防

选用合适的抗菌药，并且要有一个科学地使用方法，这样才能防止猪的细菌感染，从而改善猪的身体状况。