PD-L1激活NF-κB促进子宫内膜癌细胞上皮间质转化的作用研究

牛玉苗 黄浩 陈晓静

[摘要] 目的 探討程序性死亡蛋白配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）过表达对子宫内膜癌细胞Ishikawa上皮间质转化的影响及可能机制。方法 使用实验室构建的PD-L1过表达稳转细胞株Ishikawa/PD-L1及稳转空载对照组Ishikawa/EV，qPCR及Western blot法检测PD-L1过表达效率，Transwell和划痕实验检测细胞迁移能力和侵袭活性，Western blot法检测上皮间质转化相关蛋白表达和核转录因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）磷酸化水平。结果 与对照组相比，Ishikawa/PD-L1迁移能力与侵袭活性显著增强，Vimentin、N-cadherin、p-p65蛋白表达明显升高，E-cadherin表达明显下调。结论 PD-L1可通过诱导NF-κB信号通路激活，促进上皮间质转化，进而增强子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭能力。

[关键词] 子宫内膜癌；程序性死亡蛋白配体-1；核转录因子-κB；上皮间质转化

[中图分类号] R737      [文献标识码] A    [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.08.014

Role of PD-L1 on promoting epithelial-mesenchymal transition by activating NF-κB in endometrial cancer

NIU Yumiao， HUANG Hao， CHEN Xiaojing

Zhejiang Provincial Key Laboratory of Precision Diagnosis and Therapy for Major Gynecological Diseases， Womens Hospital， School of Medicine， Zhejiang University， Hangzhou 310006， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of programmed death ligand-1 （PD-L1） overexpression on epithelial mesenchymal transformation （EMT） in endometrial cancer cells and its possible mechanism. Methods Ishikawa/PD-L1， a PD-L1 stable overexpression cell line constructed in the laboratory and the control Ishikawa/EV were used. The efficiency of PD-L1 overexpression was detected by qPCR and Western blot assay. The cell migration ability and invasion activity were detected by scratch assay and Transwell assay. The EMT-related protein and the phosphorylation level of nuclear transcription factor-κB（NF-κB） were detected by Western blot. Results Compared with the control group， the migration ability and invasion activity of Ishikawa/PD-L1 were significantly enhanced， and the expression of E-cadherin was significantly down-regulated， whereas vimentin， N-cadherin and p-p65 were significantly increased. Conclusion PD-L1 can promote EMT by inducing the activation of NF-κB pathway， and thus enhance the migration and invasion ability of endometrial cancer cells.

[Key words] Endometrial carcinoma; programmed death ligand-1; Nuclear factor kappa-B; Epithelial interstitial transformation

子宫内膜癌近年来呈现总体发病率持续上升和年轻化趋势。据中国癌症中心2022年统计数据显示，我国子宫内膜癌发病率居女性生殖系统恶性肿瘤的第2位，新发病例约为8.2万，严重威胁女性健康[1]。尽管大多数患者为早期病变且预后较好，但仍有约13%的患者存在转移和复发风险，晚期或复发性疾病患者预后不良，5年生存率仅为17%[2]。因此，深入研究并阐明促进子宫内膜癌转移的分子机制对疾病的治疗有着关键作用。

程序性死亡蛋白配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）是一种重要的免疫检查点蛋白，通过与受体PD-1结合，抑制T细胞杀伤活性，促进肿瘤免疫逃逸。PD-L1在多个癌种中均有表达，部分晚期和转移性肿瘤中表达水平明显升高[3-4]。高表达的PD-L1可促进肿瘤细胞生长及迁移，导致疾病恶性进展[5]。PD-1/ PD-L1免疫检查点抑制剂治疗在晚期、复发性子宫内膜癌中的应用目前已逐步得到临床研究的证实，但PD-L1在子宫内膜癌转移复发中的角色和相关机制报道仍十分有限。

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是子宫内膜癌恶性进展、转移和复发的关键因素，与患者不良预后关系密切[6]。核转录因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路是重要的EMT上游调控通路，可抑制E-cadherin表达，使细胞极性丧失，迁移能力增强，导致肿瘤的耐药和转移[7]。最近研究发现，NF-κB通路相关蛋白表达水平与子宫内膜癌疾病进展相关，晚期患者中蛋白阳性表达率显著升高[8-9]。抑制NF-κB通路激活，能有效抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡。在弥漫大B细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌等多个癌种中，PD-L1与NF-κB的表达呈明显的正相关[10-12]。PD-L1是否可以通过NF-κB信号通路调控子宫内膜癌EMT而发挥作用亟待研究。

本研究利用实验室自主构建的PD-L1稳定过表达Ishikawa细胞株，着重观察子宫内膜癌细胞中PD-L1表达与EMT及NF-κB的关系，在细胞水平上初步探讨PD-L1对EMT的作用及可能的机制，为临床上抗PD-L1免疫疗法应用于子宫内膜癌提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  实验细胞及主要试剂

人子宫内膜癌细胞Ishikawa购买自ATCC；细胞总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、实时定量聚合酶反应试剂盒购自美谷生物科技（浙江）有限公司；RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；ECL化学发光超敏显色试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；PD-L1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、NF-κB p65、NF-κB p-p65、β-actin等抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；Transwell小室购自Millipore公司；划痕实验2孔插件购自德国Ibidi公司；无菌胎牛血清购自美国Gibco公司，DMEM培养基购自美国Invitrogen公司。

1.2  PD-L1过表达稳株构建

实验室使用慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1- copGFP-T2A-Puro质粒（以下简称pCDH），EcoRI、XhoI内切酶对质粒进行双酶切并回收；合成含酶切位点的PD-L1引物序列：F：3-gattctagagctagcgaattcG CCACCATGAGGATATTTGCTGTCTTTATATTCA-5，R：3-gtctttgtagtccatctcgagCGTCTCCTCCAAATGTGT ATCACT-5。以细胞cDNA为模板扩增目的基因；将扩增后的目的基因与回收载体同源重组，经转化、扩增、抽提后进行测序。测序成功后，与包装质粒共转染293T细胞，获取病毒液；感染Ishikawa细胞，经嘌呤霉素筛选获得稳定转染慢病毒的细胞株。稳定转染PD-L1过表达载体的细胞株命名为Ishikawa/ PD-L1组，稳定转染pCDH空载质粒的细胞株命名为Ishikawa/EV对照组。

1.3  RT-qPCR分析

收集对数生长期细胞，依照试剂盒说明书提取细胞总RNA，分光光度计分析测定浓度及质量，取1000ng反转录合成cDNA。采用2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix进行荧光定量PCR检测。PD-L1引物序列上游为3-GCCGAAGTCATCTGGACAAG- 5，下游为3-AGTGTGCTGGTCACATTGAA-5；β-actin引物序列上游为3-GTCATTCCAAATAT GAGATGCGT-5，下游为3-GCTATCACCTCCCCTG TGTG-5。反应体系：cDNA 1μl，上游引物0.2μl，下游引物0.2μl，SYBR green 5μl，RNase-Free H2O補至10μl。以β-actin作为内参，2?ΔΔCt法相对定量计算稳转细胞株中PD-L1 mRNA表达变化。

1.4  Western blot法检测

取对数生长期细胞，每孔加入100μl含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解30min，离心收集上清，经浓度检测、制样后进行凝胶电泳，转膜后分别用PD-L1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、NF-κB p65、NF-κB p-p65、β-actin一抗（依照说明书用一抗稀释液进行配置）4℃孵育过夜，清洗后二抗室温孵育1h，Azure400成像系统显影拍照。以β-actin蛋白作为内参，用Image J软件处理图像后得到各组蛋白表达的灰度值及蛋白相对表达量。

1.5  划痕实验

取对数生长期细胞清洗消化，用含10% FBS的DMEM培养基重悬计数，将细胞密度调整至    5×105个/ml待用。取24孔板，将Ibidi插件有黏性的一面平稳放置于孔板中，固定插件。每孔加入70μl细胞悬液，置于37℃培养箱中培养。待细胞贴壁后小心移除插件，PBS洗去残余液体，每孔加入500μl无血清DMEM培养基。在倒置荧光显微镜下观察0、24、48h两组细胞的迁移情况并进行拍照记录。使用Image J软件处理图片计算相对愈合率。

1.6  Transwell小室侵袭实验

无血清培养基和Matrigel基质胶按8∶1比例进行配置，取50μl混合液缓慢滴入小室中，避免产生气泡，随后将小室置于37℃培养箱中静置1h。取对数生长期细胞消化重悬，计数后用无血清培养基调整密度为1×106个/ml，取200μl悬空滴入小室，注意避免产生气泡。取600μl含20%FBS的DMEM培养基加入孔板下室，小心放入培养箱中，避免孔板震荡导致细胞铺板不匀。培养24h后取出小室，PBS清洗2次，4%多聚甲醛与结晶紫混合液固定染色10min，显微镜下拍照，使用Image J软件进行图像处理并计数。

1.7  统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0.2统计学软件对数据进行处理分析，样本数据符合正态分布，采用非配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  稳定转染细胞株中PD-L1表达水平检测

与对照细胞比较，Ishikawa/PD-L1细胞中PD-L1 mRNA和蛋白表达水平均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），该细胞模型可用于检测PD-L1过表达对EMT的影响，见图1、图2。

2.2  PD-L1过表达对细胞迁移能力与细胞侵袭活性的影响

与对照组比较，Ishikawa/PD-L1组细胞迁移距离更长，伤口愈合率更高（P<0.05，图2）。与对照组比较，Ishikawa/PD-L1侵袭细胞数显著增加（P< 0.05，图3）。

2.3  PD-L1过表达对EMT相关蛋白和p65蛋白磷酸化水平的影响

与对照组比较，Ishikawa/PD-L1组Vimentin、N-cadherin和p-p65蛋白表达明显增加；E-cadherin蛋白明显降低（P<0.05，图3）。

3  讨论

2013年癌症基因组图谱利用微阵列和测序技术对373例子宫内膜癌进行了基因组、转录组和蛋白质组学特征分析，将子宫内膜癌划分为4类不同预后的亚型——POLE超突变型（7%）、微卫星高度不稳定/错配修复缺陷型（28%）、低拷贝数变异型（39%）和高拷贝数变异型（26%）[13]。研究提示与其他癌种相比，子宫内膜癌发生微卫星高度不稳定/错配修复缺陷的概率最高，约占初治子宫内膜癌30%，复发性子宫内膜癌13%～30%[14]。该亚型肿瘤突变负荷高，常伴有高表达的PD-1/PD-L1，CD3+/ CD8+细胞毒性T淋巴细胞占比也显著升高，这些都为免疫检查点抑制剂提供了理想的治疗干预条件。随着基础研究的深入和临床试验的进行，越来越多的靶向药物被尝试用于晚期子宫内膜癌的治疗，但整体有效率低和患者耐受性差等限制了抗PD-1/PD-L1药物的一线应用[15-16]。深入研究PD-L1在子宫内膜癌疾病进展中的角色，挖掘新的药物靶点显得尤为重要。

最近有研究发现PD-L1在EMT、肿瘤干细胞样表型、转移等方面也具有重要作用。在食管癌中，PD-L1表達上调显著增强细胞增殖、迁移和侵袭活性，促进EMT进程。在胃癌细胞中，敲降PD-L1显著抑制细胞增殖，促进细胞凋亡和G0/G1期阻滞，体内实验也证明敲低PD-L1显著抑制肿瘤生长。在胶质母细胞瘤中，RNA测序分析显示PD-L1影响基因表达，且这些基因主要富集在细胞生长/迁移/侵袭通路中，进一步体外实验证明PD-L1过表达可通过RAS/ERK通路促进EMT[17-19]。随着研究的深入，越来越多的证据表明PD-L1表达所致的生物学行为可能与EMT存在联系。

NF-κB通路在肿瘤转移和复发中具有重要作用。在脑胶质瘤中，TGF-β1可通过NF-κB信号通路上调N-cadherin、Vimentin和Snail等蛋白表达，促进肿瘤细胞恶性进展。在结肠癌中，抑制NF-κB p65/p50核转位能显著抑制COX-2和p-AKT等表达，反转肿瘤细胞EMT。在卵巢癌中，SOS1蛋白可激活NF-κB信号通路，促进肿瘤转移[20-22]。然而在子宫内膜癌中，PD-L1是否通过NF-κB通路调控EMT却鲜有报道。

本研究发现PD-L1过表达可显著增强子宫内膜癌细胞迁移侵袭能力，进一步研究发现其作用机制可能与下调E-cadherin及诱导NF-κB p-p65、N-cadherin、Vimentin表达有关，丰富了PD-L1在子宫内膜癌恶性进展中的研究，为抗PD-L1治疗提供了实验基础。然而PD-L1调控EMT更深层的机制和潜在的药物靶点仍有待进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2023–04–26）

（修回日期：2023–11–27）