基于微环境调控的脊髓损伤修复策略及相关研究进展

张羽 窦荣声 闫浩 杨森 王炳武

脊髓损伤(SCI)是指高能量冲击下脊柱和脊髓生理连续性中断或破坏,脊髓神经回路中断,使得损伤平面以下肌肉瘫痪、感觉丧失及自主神经功能障碍,严重时甚至会危及生命。目前,全球SCI患者超过300万人;每年大约有18万新增病例,然而,国内外对发生SCI的患者尚无有效的治疗方法,这给患者的生理和心理带来了沉重的负担[1,2]。尽管在过去的几十年里,脊髓损伤患者的存活率稳步上升,但脊髓损伤个体的死亡率仍然大大超过无脊髓损伤的同龄对照组。脊髓损伤的神经预后主要取决于脊髓损伤的初始严重程度,及时的医疗和外科护理可减少继发性损伤的影响。与外周神经系统不同,脊髓属于中枢神经系统。其中,血脊髓屏障(blood-spinal cord barrier,BSCB)在脊髓损伤病程进展中起着重要作用,BSCB在功能上相当于血脑屏障,为脊髓的细胞成分提供了一个专门的微环境,对脊髓实质起着保护和调节作用,SCI后 BSCB遭到破坏,脊髓微环境中原本的平衡状态被打破,进而发生一系列病理生理变化,出现严重出血和缺氧缺血症状[3]。SCI后微环境中存在的抑制因子会影响内源性干细胞的分化,促进内源性干细胞向更多星形胶质细胞分化[4]。神经干细胞与神经元的比例失调会直接影响SCI的恢复,内源性干细胞的神经元数量不足以重建突触和神经圈,且星形胶质细胞大量存在会促进损伤部位形成一个厚厚的疤痕,对脊髓的正常功能产生不可逆转的后果[5]。因此,为了促进脊髓损伤后修复,研究者们逐渐将目光转移至SCI产生的复杂微环境的调控上来。近年来,随着对脊髓损伤病理机制的研究取得了一系列进展,特别是随着基因调控、细胞测序、细胞示踪等技术的发展,对SCI微环境的深入探索变得更加可行,并且有些已经取得了很好的治疗效果。因此,基于微环境调控的脊髓损伤修复策略前景广阔。

1 SCI后脊髓微环境的变化

微环境失衡是指组织、细胞和分子在不同时间和空间中抑制因子的增加和促进因子的减少。在组织水平上表现为出血、缺血、胶质瘢痕形成、脱髓鞘和再髓鞘形成的不平衡。细胞水平则涉及内源性干细胞分化和小胶质细胞和巨噬细胞转化表型的失衡。分子水平包括神经营养因子及其前肽、细胞因子和趋化因子的失衡。SCI的病理生理可分为两类：原发性损伤和继发性损伤[6]。原发性损伤中以创伤性脊髓损伤最为常见,通常由外部物理冲击引起,如车祸、摔伤导致的急性牵张、剪切、压迫或横断。非创伤性脊髓损伤多是由肿瘤、退行性病变、局部缺血或先天性疾病所引起[7]。创伤性脊髓损伤后几分钟内发生的原发性打击会直接损伤神经细胞,剪切轴突,在初期造成脊髓组织的毁灭性损失。同时,内皮细胞间紧密连接的结构被破坏,血管和血脊髓屏障发生损伤,从而引起一系列继发性损伤,如细胞毒性反应、神经递质积累、自由基产生、细胞死亡、脱髓鞘、轴突变性和死亡。然而,尽管许多患者在SCI后表现为临床完全性脊髓损伤,但有部分患者在神经病理学上表现为不完全性损伤,这给了我们希望,通过适当的治疗来减少继发性损伤,可能会减少脊髓损伤的功能影响。在继发性损伤阶段,微环境会发生显著变化。继发性损伤期可进一步分为急性期、亚急性期和慢性期,这三个阶段所涉及的微环境各不相同[8-9]。

在撞击后不久(10 ～ 15 min)的急性期,毛细血管丰富的中央灰质出血,白质水肿[10],如果不对出血进行干预,完全缺血周围的细胞将直接发生坏死,可进行性形成囊性空泡,并对造成不可逆的损害[11]。随后,各种细胞因子和趋化因子将迅速渗入破裂的BSCB,导致严重的炎性应激反应[12-13];在亚急性期,神经元、轴突和少突细胞大量损失,小胶质细胞、巨噬细胞和其他炎性细胞被激活,从而损伤部位发生严重的炎性反应,星形胶质细胞大量增殖且变得活跃,促进损伤部位角质瘢痕的形成;在慢性期,星形胶质细胞等细胞使疤痕进一步增厚,与亚急性期相比,可以在一定程度上限制炎症,但这也可以作为神经突生长和再生细胞迁移的物理和生化屏障。一些少突胶质细胞前体细胞(OPCs)分化为产生髓磷脂的新少突胶质细胞。

2 基于微环境调控的SCI修复策略

2.1 调节SCI微环境防止出血和局部缺血 脊髓损伤后,脊髓血管支持立即丧失,导致损伤中心周围局部缺氧,随后发生一系列分子级联反应,导致微血管通透性增加和BSCB破坏。新生血管的形成过程,在伤口愈合的增殖阶段起着重要作用,稳定临时血管和形成永久性血管网络是脊髓损伤后组织修复的必要条件。通过调节微环境以防止SCI后失血量过度和促进损伤部位血管生成来防止更多的继发性损伤反应具有重要意义。由于神经干细胞能够分化为具有功能的神经细胞,并向损伤的微环境中分泌有益的旁分泌因子,因此神经干细胞正逐渐成为脊髓损伤的再生治疗方法。Lee等[14]成功地从癫痫患者的颞叶中分离和培养了成人多功能神经细胞(ahMNCs),并以啮齿类动物SCI小鼠为模型,评估ahMNCs对SCI的治疗效果和治疗机制。小鼠挫伤7 d后,将1×106个ahMNCs移植到损伤脊髓中,由于ahMNCs旁分泌促进血管生成的活性,CD31阳性微血管数量显著增加。表明ahMNCs通过替代受损神经细胞和促进脊髓损伤微环境血管生成的作用,在脊髓损伤中具有显著的治疗效果。

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在整个神经系统中表达,具有促进神经元的增殖和有丝分裂及新生血管重建,改善BSCB的渗透性,调节损伤修复所需的微环境的稳定性等功能[15]。然而,由于bFGF稳定性差、半衰期短、结构复杂、酶失活等限制了其良好的治疗效果。而且,脊髓损伤复杂的病理生理结构往往限制了全身给药,尤其是BSCB,它阻止了大分子药物通过循环到达脊髓[16]。Wu等[17]将具有损伤病灶靶向能力的CAQK肽(Cp)和具有穿透bscb能力的R2KC肽(Rp)移植到脂质体(Lip)上制备一柔性、无创给药系统(bFGF@Lip-Cp&Rp)。该系统既可以促进脂质体穿过BSCB,又可以促进脂质体在脊髓损伤处的靶向和聚集。结果采用western blot和免疫荧光检测血管内皮生长因子A (VEGF-A)和新生血管因子血小板内皮细胞粘附分子-1 (CD31)的数量,发现bFGF@Lip-Cp处理组刺激后VEGF-A和CD31的表达量高于其他各组,证明bFGF@Lip-Cp&Rp不但可以促进脊髓损伤部位血管生成和紧密连接蛋白的表达,还增强了由微血管内皮细胞组成的新血管的完整性。为不久的将来脊髓损伤的治疗和管理提供了新的选择。

2.2 调节SCI微环境改变细胞分化 脊髓损伤的发病机制涉及多种细胞,因此通过调节微环境来改变细胞命运,使其更有利于细胞的再生具有重要意义。最常用的策略是：减少阻止再生的细胞;增加促进恢复的细胞;或者移植我们需要的特定细胞或预分化的干细胞[19]。

由于不利的微环境,NSCs不能分化为神经元[20]。因此,激发内源性干细胞的有利分化对于脊髓损伤修复具有重要意义。Li等[21]构建了一种西妥昔单抗修饰的线性有序胶原蛋白支架,将其植入到犬脊髓损伤部位后,能够显著减少病变部位的硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)沉积,减少瘢痕的形成,还可以激活内源性神经发生,实现神经元再生,包括神经元分化、成熟、髓鞘形成和突触形成。最终实现显著的运动恢复。

此外,干细胞移植能够替代脊髓损伤缺失的神经细胞,分泌促再生因子保护受损组织细胞和神经[22-23]。目前,神经干细胞(NSCs)在脊髓损伤动物模型治疗中的应用主要集中在脊髓挤压损伤模型。将NSCs移植到受损脊髓组织中,可有效促进机体功能的恢复。Lu等[24]将表达GFP的NSCs嵌入含有生长因子混合物的纤维蛋白基质中,并移植到严重脊髓损伤部位。被移植细胞可以分化成包括神经元在内的多种细胞表型,轴突传导略有改善。移植的NSCs分化形成的神经元支持电生理继电器的形成,在完全脊柱横断的部位,恢复脊髓部分功能。骨髓间充质干细胞(MSCs)移植也是治疗脊髓损伤应用很广泛的治疗方法。临床试验中用于治疗脊髓损伤的主要干细胞类型是骨髓间充质干细胞(BMMSC),其免疫原性较低,来源广泛,易于分离、伦理问题少、肿瘤发生风险低[25]。 Okuda等[26]采用抗坏血酸法制备雌性大鼠骨髓间充质干细胞片,将其移植到T-8水平2 mm大小的脊髓缺损中。移植后2周和8周,分别采用抗tuj1抗体和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体进行免疫组化分析,评估轴突再生和胶质瘢痕形成情况。结果表明骨髓间充质干细胞片在移植后2周促进了轴突再生,移植后8周,tuj1阳性轴突在薄片上明显延长。并且小鼠在移植后2周和8周后肢运动功能得到改善,这进一步证明了BNNSC在脊髓损伤治疗中的有效性。

2.3 调节SCI微环境减少炎症和强化的免疫反应 创伤性脊髓损伤发生后,脊髓组织立即重建,数周达到高峰,并会一直持续[27]。在重建过程中,损伤部位出现严重的神经炎症,导致免疫系统、血管系统和神经系统一系列变化。这些微环境的变化将反过来损害迁移的干细胞,并扩大神经凋亡,粉碎神经再生的潜力[28]。

SCI后,炎症会诱导神经元死亡,这种继发性损伤的关键介质是白细胞介素(IL)-1。IL-1会进一步诱导的其他炎性介质释放,如肿瘤坏死因子(TNF)-α和环氧合酶-2,从而加剧神经元损伤。Zhang等[29]使用慢病毒将增强绿色荧光蛋白(eGFP)和HSV1-39tk转导到嗅球细胞(OECs),并通过荧光成像和[18]FHBG研究进行监测。OECs移植到SCI动物模型中,到达病变部位的OECs可通过病变部位激活的小胶质细胞释放促炎细胞因子激活,表现为脊髓组织中白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)表达上调,促炎趋化因子IL-1α、IL-1β表达下调,大大地缓解了损伤部位的神经炎症,对脊髓损伤有很高的治疗效果。

小胶质细胞是中枢神经系统中的免疫细胞,可评估中枢神经系统是否受损或感染,吞噬死细胞和细胞碎片,并参与神经发育过程中的突触重塑。脊髓损伤后小胶质细胞被激活,释放促炎因子并引起继发性损伤,但同时它们也可以发挥有益作用,包括抑制病变扩张、清除碎片和产生抗炎因子。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)是M1表型小胶质细胞的标志物,在脊髓损伤后过度表达,并加剧炎症和神经元变性的进展。CD163 (cluster of differentiation-163)作为M2表型小胶质细胞的标志物,在神经损伤后发挥保护作用[30]。目前,来自间充质干细胞的外泌体已被证明在脊髓损伤治疗中具有巨大的潜力。Han 等[31]使用甲基丙烯酰(GelMA)水凝胶杂交3D培养的MSCs来源外泌体(GelMA-MN@3D-Exo)构建了用于SCI治疗的微针阵列贴片,可通过促进SCI后微环境中小胶质细胞由M1表型向M2表型转化,有效降低神经炎性反应。免疫荧光结果显示,与SCI组比较,3D-Exo组iNOS+小胶质细胞数量明显减少,CD163+小胶质细胞数量明显增加。这些结果进一步解释了GelMA-MN@3D-Exo移植通过有效和持续地传递整合的MSC-Exos在治疗大鼠SCI中发挥良好治疗效果的潜在机制。

脊髓损伤后的炎性反应也受巨噬细胞激活的动态平衡调节。被IFN-γ激活的巨噬细胞具有神经毒性作用,而被IL-4激活的巨噬细胞,作为M (IL-4)的手段,可以抑制有害的免疫反应并促进损伤修复[32]。在一篇报道中,Zhang等[33]将嗅鞘细胞OECs和雪旺细胞(SCs)共移植到SCI大鼠体内,探索其对损伤大鼠脊髓巨噬细胞前或抗炎因子表达和极化的影响。共移植组中,移植的细胞分布更广泛,损伤部位星形胶质细胞数量、小胶质细胞/巨噬细胞浸润、趋化因子(CCL2和CCL3)表达明显减少,IL-10、IL-13表达水平升高,IL-6、TNF-α表达水平降低,囊腔面积缩小,运动功能改善。且OEC和SC共移植可促进巨噬细胞表型由M(IFN-γ)向M(IL-4)转移,最终损伤部位炎症细胞浸润减少,炎性因子和趋化因子得到调控,为脊髓损伤修复提供更好的免疫环境。

2.4 调节SCI微环境减少瘢痕的形成 脊髓损伤后形成的瘢痕可分为神经胶质瘢痕和纤维性瘢痕。研究表明,神经胶质瘢痕形成是脊髓损伤病理的重要组成部分,在脊髓损伤急性期具有积极的神经保护作用[34]。其中星形胶质细胞在神经胶质瘢痕的形成中发挥重要作用,星形胶质细胞作为中枢神经系统的有机组成部分,对正常的神经元发育、突触形成、神经回路功能和动作电位的传播具有重要作用。但在神经炎症和缺血诱导下反应性星形胶质细胞会分化为A1和A2表型。A1星形胶质细胞上调补体级联基因的表达,这些基因会破坏突触,对神经系统有害。相反,A2星形胶质细胞上调各种神经营养因子的表达,可能对神经有保护作用。这些星形胶质细胞最终形成疤痕的星形胶质细胞,通过反应性星形胶质增生的过程阻止轴突再生和神经修复。在瘢痕形成阶段,Ⅰ型胶原在脊髓中高水平表达,通过整合素-n-钙粘蛋白途径诱导星形细胞瘢痕形成,阻止轴突再生[35]。损伤后2 d至2周,损伤部位的星形胶质细胞大量增殖,其大胞体与突起紧密连接,形成胶质瘢痕;此时,神经组织从炎性细胞中被分离出来,减轻了SCI早期的神经炎性反应。损伤后2周到6个月,星形细胞瘢痕逐渐成熟。由于胶质瘢痕和其他抑制因子(如CSPGs和髓鞘相关蛋白)的存在,轴突再生受到限制。损伤后6个月,瘢痕得到不断强化,逐渐形成囊肿和空洞。此时,疤痕成为一种坚硬的物理和分子屏障,限制了炎症扩散,然而,这也阻碍了轴突的再生和生长[36-37]。

而纤维瘢痕是由损伤部位硬脑膜和血管周围成纤维细胞活化,侵入损伤部位的增生性肥大而形成的。纤维疤痕形成机械屏障,抑制轴突再生和功能恢复,导致永久性功能缺陷[38]。成纤维细胞可减少神经元的长度,分泌细胞外基质成分(如纤维连接蛋白、Ⅳ型胶原和层粘连蛋白)并增殖肥大,形成阻碍轴突生长恢复的机械屏障。成纤维细胞还能分泌轴突生长抑制分子(CSPGs、NG2蛋白聚糖、肌腱蛋白C等),严重阻碍轴突再生和功能恢复[39]。因此,减少瘢痕的形成是修复SCI必须克服的问题。

Fan等[40]提出将3D甲基丙烯酸明胶(GelMA)水凝胶与iPSC来源的NSCs (iNSC)相结合制备了GelMA/iNSC水凝胶复合体,以促进脊髓损伤后的再生。体外实验证实iNSC能够在3D GelMA水凝胶中存活且具有良好的分化能力。以小鼠脊髓横断模型为疾病模型,评估了GelMA水凝胶在体内的神经再生效果,结果表明GelMA/iNSC植入物能够显著促进小鼠功能恢复,且组织学分析显示,GelMA/iNSC处理组的小鼠SCI部位的空洞面积和胶原沉积明显减少, 且GelMA和iNSC联合移植通过减少活化的巨噬细胞/小胶质细胞(CD68阳性细胞)明显减轻损伤部位炎症。显著抑制了GFAP阳性细胞和胶质瘢痕形成,同时促进了轴突再生,大大改善了SCI修复效果。

Wang等[41]开发了一种基于聚唾液酸(PSA)的二甲胺四环素负载纳米药物传递系统(PSM),用于脊髓损伤的协同治疗。制得的PSM具有明显的体外和体内抗炎和神经保护作用。PSM能保护神经元和髓鞘免受损伤,减少胶质瘢痕的形成,向损伤部位招募内源性神经干细胞,促进神经元再生和胶质瘢痕长轴突的延伸。从而大大改善了脊髓损伤大鼠的运动功能,发挥了较好的治疗效果。

转化生长因子β(TGFβ)是激活静息成纤维细胞的主要催化剂之一。TGFβ信号通路可激活脊髓损伤区硬脑膜及血管附近的成纤维细胞,使成纤维细胞增殖、迁移、分泌细胞外基质,促进组织纤维化过程。Jin等[42]通过对脊髓损伤小鼠连续28 d每天腹腔注射不同浓度的芹菜素,并采用Basso小鼠评分(BMS)评分、苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色评价芹菜素对瘢痕形成和运动功能恢复的影响并检测脊髓组织匀浆中纤维化相关参数的表达。采用NIH-3t3细胞和小鼠原代脊髓成纤维细胞、α-平滑肌肌动蛋白(α- SMA)、胶原蛋白1和纤维连接蛋白评价芹菜素的体外作用,以及对TGFβ/SMADs信号通路的影响。结果表明：芹菜素抑制小鼠脊髓纤维瘢痕形成,促进运动功能恢复。在体外通过抑制TGFβ-诱导的SMAD2/3磷酸化和核易位,在体内降低成纤维细胞相关参数的表达,增加神经生长因子的含量,降低肌成纤维细胞的活化和胶原纤维的形成,抑制脊髓损伤后纤维瘢痕的形成,并促进了小鼠功能的改善。

3 讨论

SCI是一种严重的生理和心理负担,目前尚无治愈方法。SCI的微环境错综复杂,微环境失衡是SCI再生和恢复差的主要原因。目前,人们已经开发出针对SCI微环境一系列的调控方法,且针对SCI微环境的治疗也表现出巨大的优势和潜力,尤其对于SCI的修复,提供了新的治疗理念。然而针对SCI微环境修复损伤脊髓的研究处于新兴阶段,仍然存在诸多技术困难,亟待进一步解决。其中,在分子、细胞、组织三种不同水平,影响SCI修复的因素众多,设计一种同时兼顾各因素的治疗手段也是一大难题。因此,进一步研究并阐明SCI微环境调控机制对SCI患者的神经功能修复具有重要意义。