HPLC-一测多评法测定连花清瘟胶囊中绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷和大黄酸

陈燕军，吴有根，魏惠珍，金浩鑫

1.江西师范大学医院，江西 南昌 330027

2.江西应用科技学院，江西 南昌 330100

3.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006

连花清瘟胶囊是由13味中药组成的复方制剂，《中国药典》2020年版仅测定连翘苷[1]，难以全面控制连花清瘟胶囊质量。有关连花清瘟制剂中多指标成分测定已有报道[2-9]。一测多评法是仅测定1个成分来实现多个成分的同步监控[10-12]。孙云波等[13]以绿原酸为内参物，采用超高效液相色谱法同时测定连花清瘟胶囊中7个成分。本实验采用高效液相色谱法，以连翘苷为内参物，通过建立绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、大黄酸的相对校正因子测定了连花清瘟胶囊中绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、大黄酸6种成分，为进一步提高连花清瘟胶囊质量评价水平提供参考。

1 仪器与试药

Waters 2695型高效液相色谱仪；LC-20AT高效液相色谱系统（岛津公司）；Agilent 1260高效液相色谱系统（Agilent公司）；Millipore－Q纯水器（美国Millipore公司）；AUW-220D型十万分之一电子分析天平（日本岛津公司）；AB-104N型万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ3200超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

绿原酸（批号110753-202119，质量分数96.3%）、甘草苷（批号111610-201908，质量分数95.0%）、木犀草苷（批号111720-202111，质量分数96.6%）、连翘酯苷A（批号111810-202209，质量分数96.4%）、连翘苷（批号110821-202117，质量分数94.9%）、大黄酸（批号110757-201607，质量分数99.3%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇（色谱纯，Fisher公司），磷酸（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），乙醇（分析纯，西陇科学股份有限公司），水为Milli-Q超纯水。连花清瘟胶囊由石家庄以岭药业股份有限公司生产，批号分别为A2203128、A2204040、B2211257、B2203209、B2204254。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、大黄酸对照品适量，加50%甲醇溶解，配制成质量浓度分别为121.52、56.20、43.30、123.72、185.04、4.76 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取连花清瘟胶囊内容物，研细，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，超声提取30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 按连花清瘟胶囊处方比例和生产工艺分别制备缺甘草、连翘、金银花、大黄的阴性样品，分别按2.1.2项方法制备，即得。

2.2 色谱条件

Inertsil ODS-3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸水（B），梯度洗脱（0～5 min，8%A；5～20 min，8%A→15%A；20～30 min，15%A；30～50 min，15%A→30%A；50～65 min，30%A→45%A；65～90 min，45%A）；体积流量：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm。按以上色谱条件进样，色谱图见图1。

图1 混合对照品（A）、连花清瘟胶囊（B）、缺甘草阴性样品（C）、缺金银花阴性样品（D）、缺大黄阴性样品（E）、缺连翘阴性样品（F）的HPLC色谱图Fig.1 HPLC Chromatograms of mixed reference substances (A),Lianhua Qingwen Capsules (B),negative samples without Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (C),negative samples without Lonicerae Japonicae Flos (D),and negative samples without Rhei Radix et Rhizoma (E),negative samples without Forsythiae Fructus (F)

2.3 线性关系考察

取混合对照品溶液，分别进样2、5、10、20、30、40 μL，记录色谱图。以绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、大黄酸峰面积为纵坐标，进样质量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。

表1 各成分线性方程和线性范围Table 1 Linearity equations and linear range of various components

2.4 精密度试验

精密吸取同一批号B2204254连花清瘟胶囊样品制备的供试品溶液10 μL，连续进样6次，测定绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、大黄酸的峰面积值，计算得绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、大黄酸峰面积的RSD值分别为1.3%、1.9%、1.6%、1.4%、1.3%、2.2%。

2.5 重复性试验

取批号B2204254连花清瘟胶囊粉末适量，平行制备供试品溶液6份，测定绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、大黄酸的峰面积，并计算质量分数，结果绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、大黄酸质量分数的RSD值分别为1.5%、3.1%、3.0%、2.8%、2.7%、3.0%。

2.6 稳定性试验

取批号B2204254连花清瘟胶囊供试品溶液，室温下分别在配制后0、2、4、8、12、24 h进样测定绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、大黄酸的峰面积值，计算得绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、大黄酸峰面积的RSD值分别为1.5%、2.8%、2.1%、1.3%、1.9%、2.4%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 回收率试验

取批号B2204254连花清瘟胶囊内容物6份，每份约1.0 g，精密称定，加入含绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、大黄酸质量浓度分别为166.00、5.71、5.14、24.60、16.60、3.71 μg/mL混合对照品溶液50 mL，制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、大黄酸的平均回收率分别为99.40%、101.0%、104.5%、98.17%、99.70%、99.58%，RSD值分别为1.12%、2.53%、3.15%、2.94%、1.41%、2.84%。

2.8 校正因子的测定

精密吸取混合对照品溶液2、5、8、10、15、20 μL，进样测定，以连翘苷为内参物，根据公式fs/i＝fs/fi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)（式中fs为内参物的绝对校正因子，fi为待测物的绝对校正因子，As为内参物峰面积，Ai为待测物峰面积，Cs为内参物质量浓度，Ci为待测物质量浓度）计算绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、大黄酸的相对校正因子，结果见表2。

表2 连花清瘟胶囊中各成分的校正因子Table 2 RCF for different components in Lianhua Qingwen Capsules

2.9 校正因子耐用性考察

精密吸取混合对照品溶液，进样测定，对连花清瘟胶囊中绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、大黄酸校正因子进行耐用性考察，分别考察色谱柱、色谱仪器、柱温对校正因子的影响，结果见表3～5。上述考察因素对连花清瘟胶囊中绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、大黄酸的校正因子无显著影响，校正因子是相对稳定的数值，可用于定量分析。

表3 不同色谱柱对校正因子的影响Table 3 Effects of different chromatographic columns on RCF

表4 不同色谱仪对校正因子的影响Table 4 Effects of different liquid chromatographic instruments on RCF

表5 不同柱温对校正因子的影响Table 5 Effects of different column temperature on RCF

2.10 样品测定

取5批连花清瘟胶囊，制备供试品溶液，进样测定，分别按外标法、一测多评法计算绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、大黄酸的质量分数和相对误差[以RSD表示，RSD＝（一测多评法计算值－外标法实测值）/外标法实测值]，结果见表6。

表6 连花清瘟胶囊中绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷和大黄酸的测定结果（n＝3）Table 6 Determination of chlorogenic acid,glycyrrhizin,luteolin,forsythiaside A,forsythin,and rhein in Lianhua Qingwen Capsules（n＝3）

3 讨论

3.1 供试品溶液的制备和色谱条件的选择

以提取率为考察指标，分别考察了供试品溶液制备时的提取方式（超声提取、加热回流提取）、提取溶剂（50%甲醇、80%甲醇、甲醇）、提取时间（20、30、40 min），结果用50%甲醇超声处理30 min可有效提取6种成分。以各待测成分色谱峰的分离度、拖尾因子为主要指标，考察了检测波长（330、280、250 nm）、流动相（乙腈-0.4%磷酸水溶液、甲醇-乙腈-0.4%磷酸水溶液），并优化了洗脱梯度，最终确定检测波长280 nm，流动相以乙腈-0.4%磷酸水溶液为佳。

3.2 内标成分和指标成分的选择

连翘苷是《中国药典》2020年版中连花清瘟胶囊的质控成分[1]。本实验条件下，连翘苷与其他成分分离良好，对照品易获得，在样品中含量变化差异不大，比较稳定，RSD值较小，因此被选择为内参物。而其他5个成分也是连花清瘟胶囊中主要特征性成分[14-17]，选择它们作为评价指标对确保连花清瘟胶囊的疗效具有重要的意义。

本研究采用HPLC-一测多评法同时测定连花清瘟胶囊中绿原酸、甘草苷、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、大黄酸等6个成分，并与外标法实测值进行比较，结果表明两者无显著差异。本研究建立的一测多评法，选用连翘苷为“内标”参照成分，在进行法定标准检测时，同时测定其他5个成分，可以节约对照品，降低分析检测成本。该法回收率高、重复性良好，为连花清瘟胶囊建立更全面的质量控制提供了新方法。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突