(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯单晶制备及其结构表征

许常旭，杨海刚，莫小鹏，胡勇，钱圣典，邵建平，王未，张俊，张强，毛龙

1.杭州艾森医药研究有限公司，浙江 杭州 310030

2.艾森医药股份有限公司，美国 圣地亚哥 CA92121

化合物(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯是奈玛特韦和其他已上市及研发中的Mpro抑制剂如先诺特韦、来瑞特韦、阿泰特韦和奥格特韦钠的关键起始原料，结构式见图1。目前国内外对于(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯的研究主要集中在合成、生产工艺方面[1-4]。(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯结构中的两个手性中心会引入到下游Mpro抑制剂中，因此确证其绝对构型将有助于相关药物的立体构型研究。单晶X射线衍射是手性化合物立体构型确证的“金指标”，能够精准分析原子的空间排布和相互间作用力，从而确证化合物的手性构型[5-6]。本研究对(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯单晶培养和热重法（TGA）、差示扫描量热法（DSC）、粉末X射线衍射（PXRD）和单晶X射线衍射（SXRD）检测，确证了其立体构型，同时确定了其晶型特征和分子间氢键关系，对相关药物的质量研究和控制具有重要意义。

图1 (S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯的化学结构Fig.1 Chemical structure of (S)-2-(tert-butoxycarbonyl)amino-3-[(S)-2-oxopyrrolidin-3-yl] propanoate

1 仪器与试剂

XTL-240体视偏光显微镜，Mettler TGA2热重分析仪，Bruker D8 Advance X射线衍射仪，Bruker D8 Venture X射线单晶衍射仪；(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯（宣城美诺华药业有限公司，批号XC023-3-221101，面积归一化法测得质量分数为99.7%）；醋酸乙酯、甲基叔丁醚（试剂级，Sigma Aldrich）。

2 方法与结果

2.1 单晶的制备

根据(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯的理化性质，参考小试实验结果可知其易溶于醋酸乙酯、二氯甲烷，微溶于甲基叔丁基醚、正庚烷，因此采用交叉混合体系：醋酸乙酯-甲基叔丁基醚、醋酸乙酯-正庚烷、二氯甲烷-甲基叔丁基醚和二氯甲烷-正庚烷进行单晶条件筛选，其中醋酸乙酯-甲基叔丁醚体系培养2 d析出透明块状晶体，其他溶剂体系未能培养出合适晶体。因此本研究选取醋酸乙酯-甲基叔丁醚体系通过溶剂自然挥发进行单晶培养。将5 mg样品溶于醋酸乙酯-甲基叔丁基醚（1∶1）体系，加热溶清后关闭加热，自然冷却，静置析晶2 d，即得到无色块状晶体。

2.2 热分析

(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯样品采用TGA和DSC进行热分析，检测过程用氧化铝坩埚，气体为氮气，升温范围为25～500 ℃，升温速率10 ℃/min，结果见图2。样品随温度升高，DSC显示在113.65 ℃处有1个尖锐的吸热峰，表明样品有明确熔点；大约160 ℃开始TGA显示样品逐渐失重，DSC出现较宽的吸热峰，表明样品开始逐渐分解。热分析表明样品熔点约为114 ℃，晶体为非水合物和溶剂化物。

图2 TGA和DSC图谱Fig.2 TGA and DSC

2.3 PXRD分析

(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯样品晶体粉末采用PXRD进行分析。检测过程用CuKα（λ＝1.540 60 nm）为辐射光源，电压40 kV，电流100 mA，2θ扫描范围3°～40°，扫描步长0.02°，扫描速率6°/min，结果见图3。样品特征峰分别位于6.433°、9.265°、13.318°、17.385°、17.675°、18.083°、18.675°、19.299°、20.235°、20.764°、21.146°、23.091°、23.849°、25.158°，与单晶结构理论PXRD结果一致。

图3 PXRD实验图谱（a）和理论图谱（b）Fig.3 PXRD experimental pattern (a) and theoretical pattern (b)

2.4 SXRD分析

衍射分析所用晶体为无色块状晶体，大小为0.42 mm×0.35 mm×0.23 mm，单晶衍射仪采用CCD面探测仪收集衍射强度数据，用CuKα（λ＝1.541 78 nm）辐射为光源，250 K温度下进行衍射数据收集。

采用直接法（ShelXT软件）解析晶体的结构。结果总衍射点为62 331，独立衍射点为6 044，可观察点[I＞2σ(I)] 5 775点，数据完整度99.8%。最终R1＝0.040 2，wR2＝0.108 5，Flack因子为0.01（4），结构可靠因子S＝1.035，接近1.0，表明权重方案适合、结构准确。最终确定晶体属于正交晶系，空间群为P212121，晶胞参数a＝8.958 5(2) Å（1 Å＝0.1 nm），b＝18.905 2(4) Å，c＝19.500 6(4) Å，α＝90°，β＝90°，γ＝90°，晶胞体积V＝3 302.67(12) Å3；晶胞内分子数Z＝8。化合物分子式为C13H22N2O5，计算晶体密度为1.152 mg/mm3。用醋酸乙酯-甲基叔丁基醚体系培养，所得晶体为非溶剂化物，此外，单晶结构的分析结果表明C4、C6手性中心为S,S构型，同时分子间存在氢键。

(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯晶体于偏光显微镜下放大10倍，获得的PLM图见图4，分子立体结构见图5，一维链状结构见图6，三维结构见图7，主要键长数据见表1，非氢原子坐标参数和等价各向同性位移参数见表2，主要键角数据见表3，氢键数据见表4。

表1 主要成键原子的键长Table 1 Bond lengths of main bonded atoms

表2 非氢原子坐标参数和等价各向同性位移参数Table 2 Atomic (C,O,N) coordinates and equivalent isotropic displacement parameters

表3 主要键角数据Table 3 Date of angle

表4 氢键数据Table 4 Data of hydrogen bond

图4 晶体PLM图Fig.4 Crystal PLM diagram

图5 立体构型图Fig.5 Stereogram

图6 一维链状图Fig.6 1D chain structural diagram

图7 三维结构图Fig.7 3D structural diagram

3 讨论

(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯是很多Mpro抑制剂的关键起始原料，包括笔者正在开发的口服药物奥格特韦钠[7]，其晶型表征和结构确证将有助于相关药物质量研究。本研究采用溶剂挥发法优选到醋酸乙酯-甲基叔丁基醚体系，培养出高质量的单晶，所得晶体使用TGA、DSC和PXRD进行晶型表征，采用SXRD进行了立体结构确证。结果表明：TGA和DSC显示晶体熔点约为114 ℃，是非水合物和溶剂化物；PXRD显示了该晶型的特征峰，并与Material Studio软件对单晶结构数据模拟的PXRD理论图谱保持一致，表明该晶型可能是(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯的稳定晶型；SXRD显示分子结构为氨基端被Boc保护，羧基端形成甲酯，中间接有吡咯烷酮；分子中心和吡咯环上各有1个手性碳原子，绝对构型为S,S构型，且分子间存在氢键，表现为两个分子的氧代吡咯烷基团的羰基和氨基互相作为氢键的受体和供体，将分子头头相连，同时Boc-氨基提供氢键给邻近分子的氧代吡咯烷羰基，将分子连接成一维超分子链，链与链之间通过分子间作用力平行堆叠，形成三维堆积结构。本研究对(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯的晶型表征和单晶结构解析为下游Mpro抑制剂的质量研究和立体结构确证提供了重要参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突