整合性接合元件及其在猪链球菌中的作用

段慧慧,于 瑞,刘忠虎,杜向党,商艳红*

(1.河南农业大学动物医学院,河南郑州 450046;2.河南牧业经济学院动物医药学院,河南郑州 450046)

猪链球菌(Streptococcussuis,SS)是危害养猪业发展的一种重要病原体,可使猪出现脑膜炎、败血症和心内膜炎等疾病[1],严重时会发生猝死现象[2]。1998年江苏省和2005年四川省暴发的两起致命性人类链球菌中毒性休克综合征,证实了猪链球菌也具有感染人并使人患病的能力[3]。抗菌药物的不正确使用导致临床分离猪链球菌耐药范围逐渐扩大,这预示着耐药机制也更加复杂。先前的研究已将猪链球菌描述为关键的抗菌药物抗性基因库和驱动抗菌药物发生耐药性进化的基因传递系统[4]。

可移动遗传元件(mobilizable genetic elements,MGEs)包括质粒、基因组岛、整合性接合元件(integrative and conjugative elements,ICEs)、转座子、噬菌体和嵌合元件,它们都可携带单/多个抗菌药物抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)且将其转移到相同/不同细菌中[3]。细菌的大多数耐药机制与ARGs表达有关,且基因的水平转移(horizontal gene transfer,HGT)在细菌耐药性方面占据主要地位,不断促进细菌发生进化。与基因的垂直转移相比,HGT能够在远亲细胞之间获得外源基因[5]。HGT的3种常见机制是转化、接合和转导[6],其中,接合机制是猪链球菌在外界压力存在时获得优势生长条件的最常见机制。ICEs是近年来在猪链球菌中发现的一种越来越常见且能够发生移动的基因水平转移载体[7]。它位于宿主细胞的染色体上,可将细菌间的基因通过接合转移的方式发生水平转移,使细菌获得更多具有多种功能且有利于其生存的适应性基因。研究证明[8]ICEs是一类兼具质粒和噬菌体特征的镶嵌元件,它依据噬菌体的方式对宿主细胞的染色体进行复制,通过质粒接合的方式对染色体进行转移。ICEs的存在对宿主细菌的进化起着重要作用,包括增强细菌毒力、对抗菌药物和重金属的抗性、生物膜形成和毒素/抗毒素系统。因此,对猪链球菌中的ICEs等可移动元件的研究是十分必要的。本文主要通过对ICEs的发现、分类、存在形式和相互作用、转移途径和相关结构作用及其与细菌耐药性和致病性等方面进行介绍,为猪链球菌中ICEs的研究提供理论基础。

1 整合性接合元件的发现

ICEs又称为接合转座子,是编码蛋白质的可移动元件,其通过接合的方式从宿主细胞转移到受体中。1967年人们在雷氏普罗维登斯菌中发现一个可对金属元素和卡那霉素产生抗性的89 kb基因元件Inc J质粒(R391)。随后,又在霍乱弧菌O139中鉴定出62 kb基因元件SXT,其能够引起流行性霍乱且携带的部分基因促使细菌对磺胺甲恶唑和甲氧苄胺嘧啶表现出抗性。由于此类元件越来越多,为了更好地研究它们的特性,人们将其统称为ICEs[7]。随着基因分析技术不断进步,R391家族和SXT家族被认定为一个家族,同时明确了SXT/R391家族目前是由40多个成员构成,核心结构包含52个保守基因和1个位于prfC基因5′端的共同染色体整合位点。它们的不同之处在于骨架结构上的4个高频插入位点处被插入了不同种类的DNA片段,使ICEs具有特殊的功能[9]。随后,在美国的1株无乳链球菌2603V/R中发现了和SXT/R391家族具有相似功能的ICEs(ICESa2603)[10]。在中国的高毒力SS2菌株中发现了89K毒力岛(89K PAI),它的出现不仅传播了四环素和大环内酯类ARGs,而且还造成了毒力基因的传播[11]。

随着生物信息技术的快速发展,人们对ICEs的研究日益增多,为了让人们更方便地获得与ICEs相关的信息,Bi等创建了ICEs数据库ICEberg(http://db-mml.sjtu.edu.cn/ICEberg/)并且不断地对其进行更新[12]。经过ICEberg对数据信息的分析,将ICEs分为了28个家族,促进了人们对ICEs在其他领域的创新性研究[13]。

2 整合性接合元件的分类

由于所有革兰氏阴性菌和大多数革兰氏阳性菌中ICEs以线性单链DNA (ssDNA)的形式传递,传递过程中涉及一种松弛酶,因此以这种方式转移的属于接合型Ⅳ分泌系统 (type Ⅳ secretion system,T4SS)[14]。然而,在放线菌中,一些ICEs以双链DNA (dsDNA)的形式发生转移,其过程涉及RepSA或RepAM型复制起始蛋白(Rep)和包含FtsK/SpoIIIE结构域的蛋白(Tra)用于易位。因此,根据整合酶分类的28个ICEs家族,又可分为T4SS型ICEs和放线菌ICEs (actinomycete ICEs,AICEs)[15]。

2.1 Ⅳ型分泌系统型整合性接合元件

T4SS是一种跨膜的多蛋白复合物,专门用于细菌中蛋白质的分泌或接合DNA的转运,从而传播耐药性和致病性特征[14]。T4SS蛋白家族分别是:激活组分(运动蛋白)家族、PG水解酶家族、T4SS支架/核心组分家族和表面因子/黏附素家族。这些蛋白家族在ICEs的转移中进行分工合作,促进它在亲缘关系密切的细菌中传播ARGs和毒力因子[16]。此外,T4SS型ICEs在接合过程中涉及到的一种特殊的松弛酶是多种蛋白DNA加工复合体的关键元件,松弛酶在转移起始处与DNA接合并切割DNA,形成的松弛酶-DNA核蛋白复合物通过Ⅳ型接合蛋白(type Ⅳ coupling proteins,T4CP)与T4SS接合,随后,T4SS通过供体细胞的细胞膜将松弛酶-DNA复合物转运到受体细胞的细胞质中[17]。

虽然接合元件已经研究了几十年,但在原核生物中ICEs的数量和多样性尚不清楚。先前的研究[18]发现ICEs是原核生物中最丰富的接合元件,但含有T4SS的部分细菌染色体缺乏T4SS共定位松弛酶,因此,推测出T4SS也许是用于蛋白质运输而不是接合。这类元素在小型基因组中占优势,与整合酶的关联较少,在质粒中也较为罕见。当然,在变形菌中,ICEs和接合质粒对不同类型的T4SS有不同的偏好,但所有类型的T4SS都存在于染色体和质粒中,且质粒与ICEs之间的转换是频繁的。虽然接合质粒和ICEs具有不同的基因组稳定方式,但它们通过接合的迁移机制却惊奇的一致,这为原核生物通过HGT从而获得基因组接合的统一观点提供了证据[9]。

2.2 放线菌整合性接合元件

AICEs[15]是在链霉菌属中发现的一类能够像质粒一样自主复制的MGEs ,大小为9～24 kb之间,它的复制起始蛋白大多是RepSA和RepAM这两类蛋白,也有一部分是Prim-Pol类型聚合酶。由于链霉菌菌属是一类革兰氏阳性、多细胞的丝状土壤微生物,它以菌丝体形式生长,遗传物质通过菌丝转移,因此,AICEs从供体到受体的过程是以双链的形式通过菌丝间的紧密接合进行接合转移的[19]。链霉菌S.coelicolorA3中多个AICEs有着不同的功能和插入位点[20];阿维链霉菌[21]中的两个AICEs以串联的形式整合在同一个tRNA-Arg位点,但二者功能独立且完整,此现象说明了它们编码的整合酶在插入到tRNA-Arg位点时具有特异性。此外,链霉菌中的AICEs还携带有一些与限制修饰系统相关的基因,这些基因主要位于MGEs上,它们的存在可抵抗外来DNA入侵宿主,对宿主形成一种保护作用[20]。

3 整合性接合元件在猪链球菌中的存在形式

到目前为止,已经报道的猪链球菌中ICEs主要以单个[5]、串联[21](ICEs-ICEs和ICEs-前噬菌体)和杂合[3](ICEs在其他ICEs中进行整合)的形式在生物界中存在并继续发挥作用。猪链球菌中报道的ICEs家族主要有Tn5252、Tn1549、TnGBS2、Tn916、vanG和ICESt3和TnGBS1家族。Tn5252家族中出现的新的染色体整合位点(ADP核糖焦磷酸酶基因)使得部分ICEs拥有6个靶基因;Tn1549家族常与Tn5252家族以串联的形式呈现;其他家族的出现频率较低[3]。研究表明猪链球菌ICESsu32457和无乳链球菌ICESa2603的接合产生了串联ICEs,在实验室条件下可在化脓链球菌菌株之间转移,ICESa2603还可以获得其他MGEs,产生“嵌合”或“复合”[22]。有趣的是,串联ICEs携带的ARGs更容易被转移到受体菌中,进而表达[23]。

4 整合性接合元件之间的相互作用

由于ICEs的存在形式多样化,它们之间的相互作用也值得研究。通常情况下,细胞内不会同时存在两种同/不同类型ICEs[7]。但SXT/R391家族却与众不同,虽然两种ICEs的接合基因几乎相同,且都拥有一个入口排斥系统(能够特异性抑制带有相同类型ICEs的细胞之间发生重复的接合转移),但是它们之间却没有编码相互排斥的基因,因此,受体细胞并没有因为已经存在的ICEs而降低自身获得另外一种ICEs的能力;且当细胞内含有SXT/R391家族两种ICEs时,它们会以串联的形式共同转移[7]。串联ICEs的出现不会妨碍它们的移动性,反而会促使种间基因发生转移[24]。与此同时,猪链球菌和其他链球菌中串联MGEs转移频率增多,这种流行趋势表明了串联MGEs在细菌进化中发挥重要作用;但值得注意的是,部分MGEs或ARGs整合到ICEs中后,会造成ICEs中原有的整合酶活性降低或与ARGs相关的元素出现衰变从而失去流动性[24]。此外,ICEs之间或ICEs与其他的MGEs(例如噬菌体)之间的相互作用可能改变插入位点特异性或产生修改宿主范围的新型ICEs[22]。

5 整合性接合元件的转移途径及其相关结构的作用

5.1 整合性接合元件的转移途径

ICEs是在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中发现的一组不同的移动元件,它能整合到细菌染色体上,具有编码功能齐全的接合机制,可在细菌细胞之间传播。ICEs又是基因岛的一员,因此,猪链球菌中ICEs从供体菌转移到受体菌的步骤为切离、裂缺、解旋、识别和整合[6]。

猪链球菌中部分ICEs能够以反式或顺式方式移动其他遗传元件,例如染色体携带的整合可移动元件(integrative mobilizable elements,IMEs)[24]和顺式可移动元件(cis-movable element,CIME)[25]。IMEs是编码自身切除和整合的基因组岛,但缺乏用于自主接合转移的完整接合装置,而CIME丢失了整合和转移基因,但保留了完整的attL和attR重组位点。这些元素虽然没有接合装置,但是经常充当ICEs和其他接合元件的便车。在嗜热链球菌中,CIMEL3catR3可以通过ICESt3的整合被ICESt3以顺式方式调动,随后作为一个复合元件切除和转移。IMEs和CIME因在链球菌中呈现出多样性被认为是比ICEs更能广泛传播毒力因子基因和获得性ARGs的重要载体[25]。

5.2 整合性接合元件相关结构在转移途径中的作用

ICEs通常由一个主干(整合与剪切模块、接合对形成模块、DNA移动和加工模块和调节模块)组成,附属基因(编码毒力因子和获得性ARGs等)被插入其中,可以赋予宿主选择性优势,使ICEs成为细菌适应和进化的重要驱动力[6]。除此之外,它还拥有位于核心区间的插入热点区(hot spots,HS)和可变区(variable region,VR),位于HS和VR的特性基因使得ICEs具有独特的功能[26]。研究证实rplL和rumA基因位点是链球菌和其他革兰氏阳性菌中的两个跨物种保守插入热点[22]。

猪链球菌ICEs中的整合酶(Int)基因和切离酶(Xis)基因是其整合与剪切模块的重要组成部分,Xis负责将ICEs从宿主细胞的染色体中切离,Int用于将切离的环状DNA整合到受体菌中[27],且Int和Xis的两端一般为attL和attR的反向重复序列。负责ICEs重组的Int通常局限于酪氨酸、丝氨酸或DDE家族。此外,猪链球菌中ICEs与T4SS存在大量相似的基因,因此T4SS在ICEs的接合对形成模块中起着很大的作用[26]。ICEs在发生接合转移前其DNA移动和加工模块可对ICEs的DNA进行加工处理,整个过程类似于质粒DNA的加工,即环状DNA与释放酶共价接合后,在转移起始位点(origin of transfer,oriT)处生成开环缺口,随后在oriT处合成单链DNA,借助接合转移蛋白G,穿过接合孔道,最终抵达宿主菌体内[8]。

ICEs的转移受多种因素的影响,这些因素对它的转移既有促进作用又有抑制作用。SXT/R391家族的主要调节因子为setR,它可以抑制setC和setD产生用于编码SXT转录的蛋白[7];ICESa2603家族拥有3个具有促进作用的特征基因,即ICESa2603rplL的Int基因(整合在无乳链球菌2603 V/R的rplL基因)、ICESa2603 tRNA Lys的2个Int基因(整合在无乳链球菌2603 V/R的tRNA赖氨酸基因和Tn916的松弛酶基因)。铜绿假单胞菌中的ICEPapi-1可以通过专门的GI-T4SS方式发生水平转移,且ICEPapi-1编码的调节剂TprA在转移过程中起诱导作用。此外,由于某些细胞会受到营养、细胞信号传导限制或两者兼有者,其体内部分ICEs具有生长阶段依赖性切除的特征[28]。

6 整合性接合元件与细菌耐药性及致病性

细菌通过HGT获得遗传信息,HGT是在不同细菌种/属之间交换ARGs的重要方式,因此它们能够迅速适应多变的生态环境,并导致菌株之间的基因序列有很大差异[5]。猪链球菌ICEs除了参与其移动、调节或维持相关的基因外,还含有多种ARGs;ICEs与其他MGEs的交换能力促使它成为ARGs储存库[23]。此外,ICEs增强了生物体定殖真核宿主、固定氮、促进生物膜形成和插入毒力基因的能力[29]。随着研究的深入,猪链球菌中ICEs可在相同/不同种属间发生转移,且能够在受体细菌中复制和表达相同的功能,赋予细菌独特的生长优势,给临床预防和治疗造成困难[5,30-32]。

近些年,世界上关于感染耐多种抗菌药物链球菌的事件逐渐增多,部分国家具有季节性和聚集性[33]。猪链球菌感染事件于1987年在曼谷被首次报道,随后世界各地均出现零星病例[33]。人类感染猪链球菌主要是表现为脑膜炎或链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome,STSS)[34],与之前流行的STSS为特征的ST1毒株相比,流行性ST7菌株中的89K毒力岛被认为是造成菌株毒力增加的原因。值得注意的是,易感人员大多从事相关职业,且发病率大多与种族起源、部落、文化和生活方式有关。

7 小结

目前报道的猪链球菌中ICEs形式多样化,可携带单个/多个ARGs和毒力基因等元素通过接合/自然转化的方式从供体菌转移到受体菌中,赋予细菌更多的生长优势,造成耐药机制复杂多样,给临床预防和治疗造成了很大程度的困难。本文通过对猪链球菌中ICEs进行综述,阐述了其发现、分类、存在形式和相互作用、转移途径和相关结构作用及与细菌耐药性和致病性等方面的研究进展,为防范猪链球菌病提供一定的思路,也为新药物和疫苗的研发提供参考。