重组酶聚合酶扩增技术在动物病原菌检测中的应用进展

张 蕾,陈 亮,江波涛,冯万宇,兰世捷,苗 艳,沈思思,李 丹,田秋丰,杨昊天,张 艳,刘雪松,黄宣凯,钟 鹏,史同瑞

(黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院,黑龙江齐齐哈尔 161000)

体外核酸扩增(invitronucleic acid amplification,NAA)技术已广泛应用于动物疫病病原体的分子诊断, 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)均已被证实是精准和高效的诊断工具。但是,此类扩增方法需要具备专业仪器、严格的加热和冷却热循环条件、高质量的核酸反应组分、熟练的操作人员和良好的实验室环境。近年来,常规PCR随着技术的发展已有所改进,但仍比较耗时。

为了突破传统PCR的局限性,学者们已经开发了基于不同酶(反应)机制和扩增系统的多种等温扩增技术,主要包括环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、转录介导扩增(transcription mediated amplification,TMA)、链置换扩增(strand displacement amplification,SDA)、解旋酶依赖性扩增((helicase-dependent amplification,HDA)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)和滚动环扩增(rolling loop amplification,RCA)等[1]。与常规PCR相比,等温扩增技术更易于在低资源配置环境中实施,并且该技术可通过去除加热和冷却步骤,允许多种分子反应同时进行,缩短了反应时间。在多种等温扩增技术中,RPA技术虽然开发较晚,却因其不依赖专业设备、操作简单、反应快速、高敏感性和特异性的特点而得到快速发展和应用[2]。迄今为止,基于RPA开发的动物疾病诊断和病原检测(病毒、细菌、真菌和和寄生虫)方法已有诸多报道。

1 重组酶聚合酶技术

1.1 反应体系和原理

RPA是一种等温扩增技术,由Niall Armes(ASM Scientific Ltd of Cambridge,UK)于2006年研发,其优势是不依赖于常规PCR反应的热循环。RPA反应体系包括3种关键蛋白、枯草芽孢杆菌DNA聚合酶Ⅰ(Bsu)或金黄色葡萄球菌聚合酶(Sau)、引物、模板和辅助组分。3种关键蛋白分别是T4 UvsX蛋白、T4 UvsY蛋白和T4 gp32蛋白。T4 UvsX蛋白是具有识别配对和转移活性的重组酶。介体蛋白T4 UvsY是重组酶负载因子。单链结合蛋白T4 gp32可优先与解开的单链DNA结合[3]。

反应体系在恒温条件下开始扩增时,重组酶T4 UvsX在负载因子T4 UvsY的帮助下与引物结合,形成重组酶引物复合物。复合物在双链DNA中寻找同源序列位点,一旦识别到靶位点,复合物直接侵入双链DNA并结合,引发链交换反应,形成D环结构,D环的另一侧仍然是单链。移位的单链则会被单链结合蛋白T4 gp32结合,以防止复合物中的引物解离[4]。随后,重组酶引物复合物在水解ATP的同时,自身构象发生改变,继而重组酶从核蛋白细丝释放出来,并可立即与另一对引物结合,开始新一轮的链置换反应。同时,引物的3′端暴露并被DNA聚合酶识别,由DNA聚合酶催化开始扩增,扩增反应从两端的正向和反向引物同时进行,合成的扩增产物不断成为新的模板,从而实现指数扩增[1,5]。值得注意的是,负载因子T4 UvsY阻碍了单链结合蛋白与重组酶T4 UvsX竞争引物结合位点,避免引物与单链结合蛋白相结合[6]。

1.2 引物和探针设计

RPA反应引物的推荐长度为30～35个核苷酸,以利于重组酶和引物形成复合物,引物过短(18～25个核苷酸)可能降低反应的速度和灵敏度,引物过长(大于45个核苷酸)则会形成二聚体和发夹结构。设计引物时,在5′端不推荐使用长链鸟嘌呤,3′端则应包含鸟嘌呤和胞嘧啶,G、C含量应为30%～70%,以及避免回纹结构和发夹结构[7]。也可以引入自回避分子识别系统(SAMRs)寡核苷酸,天然碱基被A*、T*、G*和C*取代,其中A*和T配对,T*和A配对,G*和C配对,C和G配对,但A*不和T*配对,G*不和C*配对,从而避免形成引物二聚体。对于实时荧光RPA反应中使用的Exo探针(46～52个核苷酸)和Fpg探针(32～35个核苷酸),以及侧流层析结合RPA反应中使用的Nfo探针(46～52个核苷酸)的设计,Twist D xTM商品化RPA反应试剂盒手册中有较细的描述。RPA反应的引物和探针比较复杂,要获得最佳组合,必需经过设计、优化和评估。RPA反应获得的目的片段长度应少于500 bp,多数研究成果表明最佳扩增长度是100～200 bp,然而也有学者报告扩增了79 bp和1 941 bp的目的片段[1]。

1.3 反应条件

除了保障反应顺利进行的关键蛋白和酶,RPA反应的原理决定了目标序列的选择以及引物、探针的设计是其敏感性和特异性的内在决定因素,在下文中会做详细阐述。外部影响因素则包括温度和搅拌。RPA检测不需要精确的温度控制,重组酶在25～42 ℃就可以发挥活性,然而,几个研究小组在15～50 ℃的温度范围对RPA反应进行了测试,发现产生阳性结果的临界温度应大于30 ℃,如果温度低于30 ℃,延长反应时间也无法保证RPA反应的稳定性[4,8],研究表明,RPA反应的最佳温度为37～42 ℃[9]。在反应体系中,重组酶通常可以在25 min内消耗所有ATP,所以无需长时间反应。搅拌可以促进RPA反应各组分间的相互作用,在反应开始和第4分钟对体系进行搅拌,可以提高反应效率,并且持续的温和振动也使RPA扩增结果能更快速、稳定地显示在侧流层析试纸条上[7]。

2 检测方法

2.1 常用检测方法

常规的PCR检测方法适用于RPA,如凝胶电泳和实时荧光检测。RPA扩增产物常含有蛋白质和其他杂质,不适宜直接进行凝胶电泳,因为这会影响电泳时目的基因片段的正确迁移,从而干扰结果判定。扩增产物在电泳检测前,可通过去污剂(如十二烷基硫酸钠,SDS)、加热(如65 ℃或95 ℃加热10 min)、酶消化(如蛋白酶 K)以及进行纯化回收等方法处理。其中,加热、SDS洗涤和蛋白酶K消化效果相似,相比之下,经过试剂盒纯化后的目的条带特异性更好,但纯化后会产生一些DNA损耗[10]。另外,Babu B等[11]报道,通过高速离心将待检物中的蛋白质进行沉淀,效果与在65 ℃ 加热10 min相似。实时荧光PCR技术可用于检测RPA反应过程中和反应终点的结果,然而,当使用如SYBR Green的荧光染料时,由于无法区分扩增的目的基因和引物二聚体,可能导致假阳性结果。为了避免这个问题,可以使用不同格式的探针,包括以相应酶命名的Exo、Fpg和Nfo探针。荧光PCR的常规探针与RPA不兼容(如TaqMan探针),是由于5′- 3′端的核酸外切酶活性与RPA不兼容,阻碍DNA扩增。Exo探针是与靶序列同源的寡核苷酸,它的3′端被阻断以防止探针伸长,探针两端分别携带荧光基团和淬灭基团,二者之间被四氢呋喃(tetrahydrifuran,THF)隔开,反应时核酸外切酶Ⅲ识别并切割THF,使两个基团分开,从而促使荧光产生[12]。Fpg探针与Exo探针相似,Fpg酶在碱性脱氧核糖(deoxyribose,dR)基团的位置切割并释放荧光基团,产生荧光信号[13]。在实时荧光RPA试验中,应设计和评估多组引物和探针,以获得最佳组合。

侧流层析(lateral flow chromatography,LFC)是目前应用广泛的RPA终点检测技术。RPA-LFC技术可以快速、便捷地实现结果的可视化判断,通常用来定性或半定量检测,适用于条件有限和非实验室的环境[14]。RPA-LFC技术通常使用TwistAmp®nfo试剂盒、生物素(biotin)标记的引物和羧基荧光素(carboxyfluorescein,FAM)标记的探针。反应中,携带FAM标记的探针与扩增产物反应,使5′端形成FAM标记,携带生物素标记的下游引物使3′端扩增产物形成生物素标记。经过双标记的扩增产物吸附在侧向流动试纸条样品垫上,产物上的FAM与抗FAM抗体的胶体金颗粒结合形成免疫复合物,免疫复合物在扩散的过程中,被检测线上的链霉亲和素(streptavidin,SA)捕获,从而产生颜色变化[15]。除了常用的羧基荧光素外,地高辛(DIG)或Alexa fluor 488染料也是较好的抗原候选标记。在此方法基础上,以不同的抗原标记结合生物素,设计多重检测线,同时设置内部控制,即可达到在同一扩增体系内检测不同病原基因的目的[13]。

2.2 特殊检测方法

除了常规检测方法,还有多种检测方法已经与RPA相结合,如电化学、化学发光、絮凝分析和基于硅微环谐振器 (silicon microring resonator,SMR) 的光子检测、表面增强拉曼散射 (surface enhanced Raman scattering,SERS)和CRISPR/Cas( clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated)系统。电化学RPA的原理是通过电化学活性化合物来产生与扩增产物相关的信号,一种方法是使用磁珠标记的正向引物和金纳米颗粒(AuNP)标记的反向引物,获得的双标记的扩增产物被磁体捕获到工作电极上,通过电催化析氢反应直接检测AuNP。Ng B Y C等[16]以AuNP作为RPA扩增产物的信号传感器,能够检测到低至1 CFU单位的结核分支杆菌DNA,且便携式电化学传感器的使用为即时医疗(point-of-care,POC)提供了便利。此外,也可使用差分脉冲伏安法进行基于AuNP的电化学检测。化学发光检测是将氧化或水解反应产生的化学能转化为可见光的发射。Kober C等[17]开发了一种流式化学发光DNA微阵列,使其结合等温不均匀RPA,可在1 h内定量检测军团菌以及嗜肺军团菌的活菌和死亡菌体。此方法程序相对繁琐,在联合便携式检测设备使用时,可提高其现场实用性。桥接絮凝试验是使长聚合物交联多个颗粒,从而在特定缓冲体系(如 pH和盐浓度)中从溶液中絮凝出来。一般情况下,交联的DNA长度需大于100 bp,将磁珠与RPA扩增产物混合,经过乙醇洗涤后使颗粒悬浮在低pH缓冲液中,如果形成絮凝物则说明结果阳性[18]。基于硅微环谐振器 (SMR) 的光子检测是以不对称方式进行核酸扩增,首先将一个引物固定在SMR上,核酸与之结合后可引起波导表面处折射率的变化,通过SMR 实时监测获得检测结果。DAO等报告了一种RPA-SMR与富集病原体的微流体平台相结合的方法,该系统对10 mL 尿液中沙门氏菌和布鲁氏菌的检测线分别为50 CFU和102 CFU[1]。表面增强拉曼散射 (SERS)的原理是一些分子被吸附到某些粗糙的金属(如银、铜、金等) 表面时,它们共振驱动表面电荷,产生高度局域化(等离子体)光场,使拉曼散射强度增加。Wang J等[19]报告了多重RPA-SERS检测,将纯化的扩增产物与银纳米颗粒孵育,对43例患者尿液样本进行分析,所得结果的敏感性、特异性和准确率分别为95.3%、93.0%和94.2%。 CRISPR/Cas系统是新兴的基因编辑工具,基于CRISPR的检测依赖于Cas蛋白的切割活性,当Cas蛋白结合到CRISPR RNA(crRNA)时,crRNA与靶序列特异性配对,随后诱导靶序列被酶切以及单链DNA、RNA被非靶向侧切。CRISPR/Cas联合RPA,通过靶向结合后切割荧光淬灭基团,可以放大信号来提高检测灵敏度。但是,CRISPR/Cas-RPA需要使用额外标记的ssDNA、ssRNA报告基因,增加了检测成本,该方法用于动物病原检测仍需要更多的探究[20]。

3 重组酶聚合酶技术在动物病原菌检测中的应用

RPA技术可用于检测多种目标生物,包括病毒、细菌、真菌、原生动物等。细菌是感染人和动物的重要病原,在世界范围内危害人类健康,威胁生物安全,造成巨大经济损失,快速、准确的检测是有效防治细菌性疾病的重要手段。过去十几年,动物细菌病的分子诊断技术取得了显著进步,RPA技术作为具有现场应用价值的新的等温扩增技术,在动物常见病原菌检测中已有诸多研究报道,其中,检测方法仍以凝胶电泳、RT-RPA和RPA-LFD最为常见。

3.1 革兰氏阳性菌

革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、链球菌、产气荚膜梭菌、结核分支杆菌、炭疽杆菌等,能引发动物和人体不同程度的疾病。吴华华等[21]以金黄色葡萄球菌nuc基因保守序列为模板设计特异性引物,优化扩增条件,对培养物、牛奶和肉质样本进行RPA检测,在35 min内获得了特异性强、灵敏度高的结果。徐健皓等[22]基于金黄色葡萄球菌femB基因设计并优化引物和Exo荧光探针,建立了金黄色葡萄球菌实时荧光 RPA检测方法,可在39 ℃、5～10 min快速检出最低量为 3.82 fg的金黄色葡萄球菌基因组DNA,检测模拟临床血液样本的敏感性好,有潜力应用于现场快速检测。基于RPA-LF可视化技术,两组研究分别报告了针对猪肺炎链球菌2型的cpsJ2基因和猪链球菌谷氨酸脱氢酶(gdh)基因设计引物、探针,建立了比细菌分离和常规PCR方法更高效率的RPA-LF检测法,有效指标评估和临床检测适用性较好[22-24]。由于叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)能穿过死亡细菌的细胞膜与 DNA 结合。Chen J等[25]首次使用PMA处理的DNA作为模板,排除杂质DNA产生的假阳性干扰,开发了快速、准确的化脓性链球菌和无乳链球菌双实时RPA检测系统,适用于食品和临床检测。炭疽杆菌作为烈性传染病病原体,其快速准确的诊断深受重视。王素华等[26]根据炭疽杆菌BA5445保守基因序列,建立了最低检测线为100拷贝/μL的RPA检测方法,该方法对被炭疽杆菌污染的毛皮标本的检出率为65.71%,稍低于RT-PCR(71.43%),具有重要的临床诊断和防控价值。两组研究分别报告了单核细胞增生李斯特菌 RPA-LFD 检测系统与qRPA和免疫磁分离(immunomagnetic separation,IMS)相结合的技术。前者在基因组上选取多组序列设计、优化引物,完全去除了引物二聚体的假阳性干扰,后者用IMS技术对样品进行预处理,达到了纯化和浓缩样本、排除干扰的目的,提高了敏感性和特异性[27-28]。此外,RPA技术还应用于产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、白色念珠球菌等的快速检测[29-31]。

3.2 革兰氏阴性菌

革兰氏阴性菌包含有多种常见的动物病原菌,RPA技术问世以来已经在此领域报告了许多新的检测方法。刘婧文等应用RT-RPA技术在20 min内完成了对人工污染大肠埃希氏菌样品增菌9 h培养物的定性检测,最低检测限为0.01 ng/μL。McQuillan J S等[33]针对大肠埃希氏菌ybbW基因设计RT-RPA方法,在3 min内可获得检测结果,对从99株大肠埃希氏菌提取的DNA检出率为100%,最低检测限为100拷贝/μL,并排除了30种非目标菌。针对大肠埃希氏菌O157:H7 的RPA-LFD技术不仅能快速、灵敏地检测出饮用水和生牛乳中的大肠埃希氏菌,还通过结合PMA处理做到了仅检测大肠埃希氏菌O157:H7活菌,检出限为102CFU/mL[34-35]。不同血清型的沙门氏菌对人/动物具有致病性,已报道的针对鼠伤寒沙门氏菌开发的RPA-LFD检测方法不仅最低检测限可达到1 CFU/μL,并且通过在引物和探针序列中引入特定的替换碱基,经分析和筛选,消除了引物二聚体和引物-探针复合物的假阳性干扰[36-37]。Stringer O W等[38]报道,针对胸膜肺炎放线杆菌种特异性apxIVA基因建立了最低检测限为10拷贝/μL的RPA诊断方法,对61份临床样本进行检测,结果敏感性和特异性分别为84.3%和100%,同时,将14份肺组织样本直接在FTA卡上形成印记,RPA检测结果的敏感性和特异性分别为76.9%和100%,表明该方法用于现场筛查病原菌是可行的。多杀性巴氏杆菌可引发家畜呼吸道疾病和出血性败血症,以KmtⅠ基因为靶序列建立的RPA-LFD检测方法能在39 ℃、30 min内检测到多杀性巴氏杆菌,最低检测限为120拷贝/μL,对临床样本检测结果显示出高敏感性和特异性[39]。 张珊珊等[40]基于布鲁氏菌bcsp31基因序列保守区建立的RPA-LFD检测方法,最低检测限为5.89 CFU/mL,对比酶联免疫吸附试验(ELISA),临床样本检测结果一致。溶血性曼氏菌、多杀性巴氏杆菌、睡眠嗜组织菌和牛支原体是引发牛呼吸道疾病(BRD)的4种主要病原体,Conrad C C等[41]基于以上病原的种特异性基因、7种耐药基因和整合结合元件(ICE)设计并验证了11种RPA反应,建立了多重RPA检测方法,并对100份牛场采集的深鼻咽拭子进行试验,与培养法和常规PCR相比,该方法能在更短的时间内从样本中直接鉴定4种病原体和AMR/ICE基因,具有作为BRD和耐药基因现场检测工具的巨大潜力。RPA技术在革兰氏阴性菌检测方面的开发还包括空肠弯曲菌、鼠疫耶尔森菌等,兼具反应时间短、灵敏度高和易操作的特点是RPA与其他分子生物学方法相比较的优势[42-43]。

4 小结与展望

RPA是一种新兴的等温扩增技术,自2006年首次被报道以来,该技术在刊物发表、普及度和应用方面均呈指数增长。学者们除了对RPA的应用做了广泛的研究外,还在寻求进一步提升RPA性能的方法。RPA在等温扩增技术中具有简单、快速、敏感性高和环境要求低的突出优势,并且与其他检测技术的兼容性好。此外,即使样本是粗提或存在PCR抑制剂,RPA也可以在20 min内实现对低浓度模板的扩增。然而,RPA也存在一些局限性,RPA试剂盒供货商的单一可能会影响其定价,也限制了用户的灵活使用。并且,由于RPA灵敏度较高,检测容易受到气溶胶污染,未来的研究可考虑建立DNA 提取与RPA反应一体的系统或试剂盒,降低暴露和气溶胶污染的可能性。需要注意的是,RPA的实时扩增反应是基于时间阈值而不是周期阈值,而时间阈值受到模板浓度、温度和混合步骤的影响,为了能更好的控制实时RPA,建议减慢反应速率和降低乙酸镁浓度。RPA对引物和探针有严格的要求,但目前尚没有设计软件和成熟的设计方案,未来可以开发相关引物、探针的设计软件或网站,用于筛选最佳的引物、探针组合,从而提高检测效率。

细菌性病原体危害全球养殖业,造成巨大经济损失,并威胁人类的健康、生命和公共生物安全,为了满足对病原体的检测要求,必须建立灵敏、快速、特异、多元的检测方法。虽然RPA技术已在人的医学和药学广泛应用,并开始用于检测人畜共患病病原体,但是其在动物疾病检测中的应用还不够先进和多样化,将RPA与便携式设备、生物传感器、横向流动装置和微流体设备等结合,开发用于动物疾病现场诊断的便携、易操作和多重分子诊断方法,将成为重要的研究领域,有巨大的潜在应用价值。