禽致病性大肠埃希氏菌生物被膜形成的调控机制研究进展

于鲁敏,信 阳,杨传宗,罗 茜,高艳宏,薛 挺

(1.临沂大学农林科学学院,山东临沂 276000;2.安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥 230036)

禽致病性大肠埃希氏菌(avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)是肠道外致病性大肠埃希氏菌(extra-intestinal pathogenicEscherichiacoli,ExPEC)的一个亚群,能够引起鸡、鸭、鹅等禽类局部或全身性肠道外感染性细菌病,并伴有多器官损伤的复杂性综合征,比如气囊炎(Airsacculitis)、心包炎(Pericarditis)、腹膜炎(Peritonitis)、 多发性浆膜炎(Polyserositis)、滑膜炎(Arthromeningitis)、骨髓炎(Osteomyelitis)、 败血症(Septicemia)、全眼球炎(Panophthalmitis)、骨关节炎(Osteoarthritis)、肝周炎(Perihepatitis)、肉芽肿(Granuloma)、蜂窝组织炎(Cellulitis)、输卵管炎(Salpingitis)和卵黄囊感染(Yolk sac infection)等,统称为禽大肠杆菌病,从而导致禽类的高发病率和高病死率,同时不但对世界养殖业造成重大的经济损失,而且限制了养禽业的健康发展[1-4]。近年来的研究证明APEC能够通过禽类及其产品或者其他感染方式引起包括人在内的哺乳动物疾病,表明APEC是人兽共患病的潜在病原体[5-6]。因此,控制APEC的感染具有十分重要的意义。研究发现,细菌生物被膜的形成不但增强细菌对抗菌药物的耐药性,而且导致宿主持续和反复性感染[7-8]。为了了解由生物被膜引起的APEC感染,本文概述了生物被膜的形成过程及各调控系统对生物被膜的影响,以期探寻破坏生物被膜形成的新策略,从而控制由生物被膜引起的感染和抗菌药物耐药性。

1 生物被膜

在APEC感染宿主的过程中,生物被膜的形成有助于APEC从免疫系统中逃逸而持续定植于宿主细胞,引发禽大肠杆菌病[9]。生物被膜是生长在生物表面的微生物群落,它们在一个由胞外多糖、蛋白质和eDNA组成的自产胞外基质中紧密地黏附在一起[8-9]。生物被膜的形成是一个非常复杂的过程包括可逆黏附、不可逆黏附、微菌落形成、生物被膜的成熟和解离5个阶段[10-11]。生物被膜的早期黏附阶段由多种细胞表面附属物,如鞭毛、Ⅰ型菌毛、Curli菌毛以及胞外多糖(如纤维素、可拉酸等)参与附着在生物表面[8,11]。在生物被膜的成熟过程中,细菌细胞的增殖导致微菌落的扩大,从而达到数百微米的厚度,并展示出复杂的结构和功能骨架[8-9]。而生物被膜的解离有利于浮游细菌的传播和寻找新的定植区域,以促使浮游细菌开启生物被膜形成的新一轮循环[7]。生物被膜是APEC的一层保护膜,用于保护APEC免受抗菌药物治疗和逃避宿主的免疫应答,从而导致宿主持续和反复性感染,并且很难被预防、控制和清除[12-13]。因此,详细阐释调控APEC生物被膜形成的分子机制对探寻抗生物被膜感染的药物靶标变得尤为重要。

2 调控系统

为了更好地适应宿主细胞外环境的变化,APEC已经发展了一系列严密的调控系统,这些调控系统在生物被膜形成的每一个阶段均有参与,以调控生物被膜相关基因的表达,进而维持生物被膜结构的完整性[11]。该调控系统主要包括群体感应(quorum sensing,QS)、双组份系统(two-component system,TCS)和第二信使(second messenger,SM)等[14-16]。其中,自诱导物-2 (autoinducer-2,AI-2)、BasSR和环二鸟苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c-di-GMP)均在信号传导途径中发挥了重要的作用,并参与调控生物被膜的形成[12,17-18]。

2.1 自诱导物-2群体感应

QS是一种细胞与细胞交流的过程,在此过程中细菌细胞利用其自身分泌的化学分子也称为自诱导物(autoinducers,AIs)来调节特定的生理功能,以响应群体密度的波动,从而更好地适应外部环境[1,14]。当AIs浓度达到阈值时,能够触发下游基因的表达,进而引起细菌的群体性变化并且调节细菌的各种生理特性,如生物发光、细胞运动性、毒力基因表达、抗菌药物敏感性和生物被膜形成等[19-20]。其中,AI-2 QS被许多革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌产生,并且在细菌种内和种间的通讯中起了重要的作用[21]。在E.coli中,胞外AI-2的浓度在指数期达到阈值水平时,激活信号转导级联反应以促使ATP结合盒转运蛋白体摄取和修饰AI-2[1]。随后,胞内AI-2被胞质激酶LsrK磷酸化形成活性分子AI-2-P,该分子与其胞内受体LsrR结合以激活QS系统,进而调控毒力基因表达、抗菌药物敏感性和生物被膜形成等[1,2,11,14]。为此,有学者提出,通过抑制QS的方式抑制生物被膜的形成,进而控制E.coli感染[14,21]。

2.2 BasSR双组份系统

TCS是一种独特的对外部环境持续监控的系统。致病菌依靠它检测环境中各种生理因素的变化,并据此迅速调节自身的结构和生理行为,以达到适应新环境和生存繁殖的目的[22-23]。在TCS信号传导通路中,TCS参与调控生物发光、生物被膜形成、致病基因的表达以及抗菌药物耐药性等多种生物过程[15]。BasSR是一个典型的TCS,由位于细胞膜上的组氨酸激酶(histidine kinase,HK)和位于胞浆内的响应调节子(response regulator,RR)组成,其功能研究已有相关报道,如在E.coliK-12中,BasSR不仅调控膜结构的形成和修饰相关的基因表达,而且调控压力响应细胞功能的基因表达,包括生物被膜形成的主要调节子CsgD[24];而在APEC临床分离株中,BasSR不仅特异性结合多重药物外排泵EmrD的启动子以激活EmrD的表达,进而影响APECX40对多西环素、四环素、环丙沙星、诺氟沙星、林可霉素、克林霉素、SDS和红霉素8种抗菌药物的耐药性[25],BasSR还通过调控生物被膜形成相关基因bcsA、csgA、fliC、fimA、motA和wcaF的表达,进而增强APECX40生物被膜的形成[26]。该研究为探究TCS调控生物被膜形成的分子机制奠定了基础,也为抑制TCS以破坏生物被膜形成提供了新线索。

2.3 环二鸟苷酸

SM是细胞表面受体接受胞外信号后通过一系列酶促反应在胞内产生的一种小分子物质[27]。细菌中常见的第二信使包括环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、鸟苷四磷酸(guanosine tetraphosphate,ppGpp)和c-di-GMP等[27]。其中,c-di-GMP是近年来发现的广泛存在于细菌中的一种第二信使分子,与细菌的致病性、运动性、毒力、鞭毛合成、生物被膜的形成以及细胞分化等生物功能过程密切相关[28]。一般来说,低浓度c-di-GMP与浮游细菌的运动性和高致病性有关,而高浓度c-di-GMP促进细菌细胞表面黏附、生物被膜形成以及慢性感染[29]。在c-di-GMP信号传导途径中,胞外信号经传导后转变为c-di-GMP的浓度变化,而c-di-GMP的浓度受二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)的调控[27,30]。研究发现,肠出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)O157:H7 c-di-GMP PDE VmpA的失活增强生物被膜形成以及降低其泳动性[31];而E.coliK-12 c-di-GMP PDE YfgF参与调控K-12细胞表面的重塑、c-di-GMP浓度变化以及生物被膜形成[32]。这些结果为干扰c-di-GMP代谢和信号传导以控制生物被膜形成奠定了基础,并为探寻破坏生物被膜的形成提供了新思路。

2.4 两个系统间的互作研究

近年来,尽管c-di-GMP信号网络将环境刺激与细菌细胞的特定适应性反应建立了关联,但是仍然存在许多问题有待解决,如依赖于c-di-GMP的不同调控通路之间的相互作用是如何被规避的?以及c-di-GMP信号网络是如何与细菌细胞中其他的调控网络相互联系的?基于上述问题的研究已有相关报道,如Liu Y T等[33]报道,RstAB TCS通过调节c-di-GMP浓度控制EHEC O157:H7生物被膜的形成和毒力因子的表达。Li S Y等[34]报道,AI-2 QS通过激活YeaJ DGC诱导鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)胞内c-di-GMP合成,进而调控生物被膜的形成和Ш型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)活性以影响S.typhimurium的致病性。作者前期研究工作发现,BasSR TCS通过调控c-di-GMP PDE YfgF影响APEC生物被膜的形成[1]。这些研究表明,QS和TCS信号通路整合到c-di-GMP,进而调控生物被膜的形成和毒力因子的表达。这或许为干扰c-di-GMP代谢以破坏生物被膜的形成或预防细菌感染提供了新途径。

3 展望

生物被膜形成是一个非常复杂的过程,包括可逆黏附、不可逆黏附、微菌落形成、成熟和解离5个阶段。在生物被膜形成的每个阶段中,都需要多个系统共同参与调控生物被膜相关基因的表达以促进生物被膜的形成和维持生物被膜结构的完整性。尽管学者们在分子水平上已经详细的阐明了生物被膜的形成机制,以及QS、TCS、c-di-GMP 等系统均参与调控生物被膜形成的分子机制,但是仍然没有提出任何破坏生物被膜形成的新策略[7]。因此,充分了解多系统间的互作网络以及多系统共同调控生物被膜形成的分子机制仍然是一项艰巨的挑战。换言之,探寻多系统互作或者共同调控生物被膜形成的中间调控蛋白,或许可以作为破坏生物被膜形成的研究策略。希望通过本文的概述,利用中间调控蛋白阻断生物被膜的早期黏附,以期从源头破坏生物被膜的形成,从而为控制由生物被膜引起的抗菌药物耐药性和慢性感染或持续性感染提供研究方向,最终为彻底治疗与生物被膜相关的疾病带来希望。

被动治疗是养禽业中一件不得已而为之的事情,只有严格认真地做好了平时的预防工作,才能保障养禽业的健康发展。在禽病防控过程中,要做到给禽群以舒适的饲养环境,平衡的日粮营养,良好的饲养管理,科学合理及时的药物预防,只有这样才能够阻止各种致病菌的侵入,以防止禽群受到疾病的危害,真正做到“养防结合、养重于防、防重于治、预防为主”的综合防控措施,从而提高禽群的健康水平和抗病能力,控制禽群不发病[35]。