异种移植存在的问题及国内发展现状

窦科峰，张 玄，陶开山

(空军军医大学西京医院肝胆外科，陕西 西安 710032)

异种移植是将动物源性的活细胞、组织、器官以移植、接种或注射的方式植入人体内的过程。作为解决器官短缺问题的潜在途径之一，异种移植因猪源性异种抗原αGal、Sda和Neu5Gc的发现和鉴定[1]以及CRISPR/Cas9基因编辑技术的进步得到了快速发展[2]。许多猪到非人灵长类动物(non-human primate，NHP)的临床前研究已证实，移植猪器官的受体能够获得长期存活，其中肾移植最长存活时间超过2年[3]，心脏移植最长存活近1年[4]。经过基因改造的猪器官在抑制异种移植超急性排斥、急性排斥、凝血紊乱、炎症反应等方面都有显著效果[1]，如何进一步选择最佳基因编辑组合，优化免疫抑制方案控制排斥和感染，利用辅助用药控制炎症和凝血障碍等是当前亟需解决的问题[5]。以脑死亡患者为受体的亚临床试验说明异种肾脏[6]、心脏移植早期移植物能够有效发挥生理功能，并未见排斥反应，其临床应用有可行性[7]。而2例异种心脏移植的临床试点研究说明，异种心脏能够发挥早期替代作用，但仍然存在后期无法控制的排斥问题[8]。本文现就异种移植涉及的器官短缺、发展简史及前沿、存在的主要问题、国内发展动态等方面进行论述，旨在为学科建设提供指导。

1 全球器官短缺难题

器官移植是人类改变传统治疗方式、挽救各种器官衰竭患者生命的一种新的医疗模式，为医学领域带来了革命性的变化。近年来，随着外科手术技术的进步和免疫抑制药物的发展，器官移植手术技术不断成熟，移植患者生存率和移植物存活率均不断提高。在我国，肾移植患者术后1年和3年的生存率分别达到97.7%和96.1%，肝移植患者术后1年和5年的生存率分别达到83.7%和68.9%，心脏移植患者术后1年和5年的生存率分别达到85.1%和75.2%[9]。目前，器官短缺已成为该领域的世界性难题。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)统计，全球每年约有200万人需要器官移植，仅约10%的患者能够等到合适的移植器官。如2022年，美国登记等待器官移植患者106 849例，完成器官移植患者42 887例，器官供需比约为1∶3[10]。同年，我国登记等待器官移植患者135 450名，完成器官移植患者20 225名，器官供需比约为1∶7[9]。如何克服器官短缺是未来移植领域发展必须面临的难题。

2 异种移植发展简史

1682年，人类历史上尝试了第一次异种移植，一名俄罗斯贵族在战斗中失去部分头皮和头骨，医生用一块狗头骨成功修复头骨缺陷，但俄罗斯教会认为，人头上有狗骨头不能是基督徒，威胁要将这位贵族逐出教会。这个敬畏上帝的人，选择把狗骨头碎片取出，他认为信仰比生命更重要。因此，第一次异种移植是不被宗教认可的。1838年，人类历史上进行了第1例猪到人的角膜移植。20世纪初，人们分别尝试将兔、绵羊、猪、黑猩猩器官移植到人身上，但因无法避免“超急性排斥反应”，各项试验均以失败告终。20世纪60～90年代，人们尝试将黑猩猩和狒狒肝、肾、心移植给人类，由于使用了免疫抑制剂，受体存活时间从2 h到几周到9个月不等，异种移植获得了初步成功。20世纪90年代后，猪取代NHP，成为首选异种移植器官来源。为了促进异种移植发展，给读者提供跨越物种障碍的器官和组织移植领域的新发现，异种移植专刊Xenotransplantation在1994年创刊。1998年，国际异种移植协会成立，旨在促进异种移植成为一种安全、道德和有效的治疗方式。2002年，世界首个α-1，3-半乳糖转移酶敲除(GGTA1-knockout，GTKO)猪诞生，成功克服超急性排斥反应，异种移植发展进入快车道。2012年，新的基因编辑技术CRISPR/Cas9的出现使供体猪的基因编辑过程更快速、更简单、更精准，并且，基因编辑猪的培育周期显著缩短、培育成本大幅降低。进入21世纪，异种移植发展正式走向了基因编辑猪的时代，异种移植的NHP试验不断取得突破，异种移植被科学界寄予厚望。

3 异种移植发展前沿

异种移植是最具潜力解决器官短缺问题的途径之一，也是移植领域的主要发展方向之一[11]。近年来，异种移植研究取得了一系列重大突破性进展，被预测会掀起下一次的医学革命。①临床前试验：2021年，“2-基因”编辑猪-猴肾移植受体猴存活557 d[12]。2022年，“7-基因”编辑猪-猴原位心脏移植受体猴存活264 d[4]。2023年，“4-基因”编辑猪-猴原位辅助性肝移植受体猴存活34 d[13]。2022年，GTKO猪-猴坐骨神经替换桡神经移植获得成功，受体猴手臂恢复运动功能[14]。2023年，GTKO猪-猴肺动脉瓣移植获得成功，实现置换瓣膜的生长和自我修复。②亚临床试验：2021年，美国两家研究机构同时开展基因编辑猪-脑死亡患者肾移植获得成功，观察期内(54 h[6]和74 h[7])移植猪肾功能均良好。2023年，GTKO猪-脑死亡患者肾移植取得新进展，1周[15]和2个月的观察期内，移植猪肾未见排斥现象，并能正常发挥功能。2022年，“10-基因”编辑猪-脑死亡患者心脏移植亦成功开展，72 h观察期内移植心脏功能正常。③临床试验：2022年，国际首例基因编辑猪-人原位心脏移植成功开展，患者最终存活了2个月，移植终点心脏出现排斥，心室壁肥大，心室体积缩小，怀疑死于猪巨细胞病毒感染[8]。2023年，同样采用“10-基因”编辑猪作为供体，世界第2例基因编辑猪-人原位心脏移植相继开展。术后患者可自主呼吸，心脏功能良好，没有使用任何辅助设备，并开始恢复肌力。最新报道，患者移植心脏出现排斥，于术后41 d死亡，具体死因仍待分析。此外，2023年，美国已注册了国际首个单臂Ⅰ期基因编辑猪肾移植的临床试验，计划利用10-基因编辑猪为20名肾衰患者进行临床肾移植。

4 异种移植存在的主要问题

猪器官移植应用于临床面临着几大挑战[5]：①免疫与技术挑战[16]：预防超急性排斥反应和急性排斥反应是异种移植获得成功的关键。目前，αGal抗原的敲除已基本解决了异种器官移植的超急性排斥反应问题。同时，Sda和Neu5Gc抗原的敲除进一步减弱了体液性排斥反应的程度。然而，基因编辑可能并不总是像预期的那样有益，Neu5Gc抗原表达缺失似乎暴露了另一种聚糖(被称为“第4种异种抗原”)，该聚糖在NHP中具有抗原性，但在人类中没有[17]。NHP抗体对第4种异种抗原的反应已被证明是有问题的，猪到NHP模型可以说不再具有猪到人模型的代表性。然而，对于临床试验，删除3种异种抗原的表达将是有利的，因为人类没有针对这些猪细胞的抗体。此外，预防补体介导的毒性反应、控制过度激活的炎症反应、改善凝血功能失调、调节围术期的移植物功能障碍等是目前临床前试验中面临的问题。有证据表明，通过转入一种或多种人补体调节蛋白(如CD46和CD55)[18]和一种或多种人凝血调节蛋白(如TBM和EPCR)，可以进一步保护人体免受先天免疫反应的影响。此外，转入抗炎蛋白(如HO-1和A20)和抗巨噬细胞蛋白CD47也可能是有益的[18]。②生理学挑战[19-20]：克服移植物的血流动力学和生理学方面与人的差异是异种移植面临的第二个障碍。猪的血流动力学与人有差异，且猪的器官移植入人体会受到人体微环境影响，如异种心脏移植后移植物在受体内过度生长，目前可采用生长激素受体敲除的方式克服此问题；异种肾移植和肝移植后会出现生理兼容差异，猪源红细胞生成素和猪肝合成的多种蛋白能否完全替代人源仍是未知的问题，需要进一步探索等。此外，供-受体来源的组织因子释放，会启动凝血级联途径，而移植猪肝合成的凝血因子等存在种间分子不兼容，导致纤溶-凝血系统失衡，经炎症反应放大，移植物实质发生出血和形成广泛的微血栓，并引发消耗性凝血障碍。值得注意的是，凝血紊乱在心[21]、肾[22]移植时，病理程度相对较轻，而在肝[16]、肺[23]移植时表现非常典型，会严重影响移植物功能和长期存活。因此，对于异种肝移植而言，控制炎症反应，并积极改善凝血紊乱问题显得尤为重要。③感染的挑战：跨物种感染是异种移植不得不预防的问题。尽管猪和人的亲缘关系较远，跨物种感染的风险相对于NHP要低，但仍然要预防猪源性细菌、病毒、真菌和寄生虫等对受者造成的感染以及随之带来的社会性感染风险。现有的无指定病原体级饲养环境联合供体猪的剖宫产，能隔绝大部分的细菌、病毒、寄生虫等。最受关注的猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)内嵌于猪基因组，需通过基因敲除的方式去除，目前已有PERV敲除联合多基因编辑猪(“13-基因”编辑猪)的异种心脏、肝脏和肾脏移植临床前试验开展[24]。④社会与伦理挑战：包括社会的认可度、相关的法规、分配制度与公正性、动物的权利和知情同意等。最近的一项异种移植接受度的定性调查显示，绝大部分普通人群是能接受异种移植作为治疗手段的，特别是等待器官移植的患者，接受率超70%[25]。移植人群及公众的担忧因素包括人畜共患病的传播、移植功能低下、身份的改变、社会污名、宗教信仰、动物伦理等。

5 国内异种移植发展现状

在异种移植研究领域，世界首例GTKO猪[26-27]、首例PERV敲除猪[2]，均出自我国科学家之手，我国的供体猪基因编辑水平和繁育能力已达到国际领先或先进水平[28]。目前，我国的异种移植研究机构已经遍布全国，总数超过30余家[29]。其中，四川省医学科学院、云南农业大学、南京大学、吉林大学、中南大学、中国科学院广州生物医药与健康研究院等单位在基因编辑猪的培育方面取得了重大进展[29]。空军军医大学[30]、华中科技大学、中南大学、中山大学、海南医学院、首都医科大学、浙江大学、深圳大学、四川省医学科学院等单位在异种器官移植的NHP试验方面取得了重大突破。空军军医大学完成了国内首例GTKO猪-猴异种肝移植研究[30-31]；国际首例PERV敲除多基因编辑猪-猴异种肝、心和肾移植，并两次突破肝移植受体存活世界纪录；国际首例多基因编辑猪-猴多器官多组织联合移植(肝肾联合移植、心、皮肤、神经、角膜和椎间盘移植等)。在此基础上，还进一步完成了国内首例多基因编辑猪-猴的特重度烧伤患者皮肤移植，并取得满意临床疗效。同时，首都医科大学、中山大学、四川省人民医院和中南大学亦分别开展异种心、肝和肾移植的NHP试验。中南大学、深圳大学、空军军医大学也陆续在开展猪胰岛、皮肤移植研究。中南大学2013—2017年成功将新生猪的胰岛细胞移植给10位患1型糖尿病的患者，这些患者病情得到明显改善，移植综合评分高于日本同类研究。目前，国内常规免疫抑制剂方案的猪-猴异种肾移植，最长存活时间已成功突破2个月。此外，全球异种移植临床研究国际研讨会已经两次在我国召开，会议共同起草了针对WHO所有成员国的临床异种移植研究规范《长沙宣言》[32]。同时，为推进国内异种移植临床研究的安全、顺利开展，规范异种移植临床研究行为，根据相关法律和规范，中华医学会器官移植学分会异种移植学组，从总则、项目申请与审查、技术标准、伦理要求、生物安全、项目管理、供体要求、受者选择、项目实施、追踪随访等方面，也制定了我国的异种移植临床研究指导意见[33-34]。

6 结束语

现在，异种移植已经跨越完成了“原初探索”“基础理论体系构建”“异种抗原及免疫调节基因功能鉴定”与“猪-非人灵长类异种移植”四个阶段，开始进入第五阶段(猪-人异种移植)。近年来，全球异种移植正蓬勃发展，市场规模呈现逐年上升态势，预测2032年将达到260亿美元，异种移植的未来市场需求和发展空间将十分巨大。美国现有多家大型医药公司正在该领域进行长期投入，包括eGenesis、Makana Therapeutics、United Therapeutics等。并且，欧美国家也已经逐步开展了异种器官移植的临床试点研究。我国在异种移植领域正面临着巨大的契机和挑战，我们应加强投入和政策引导，鼓励相关企业加入，重视异种移植研究工作，完善医疗级大动物繁育设施建设，抢占行业技术制高点。同时，加强政府监管和伦理论证，推动制定相应政策和行为规范。异种移植是一个复杂的系统工程，涉及医学、动物学、畜牧学、微生物学、遗传学、伦理、法律、心理学等，因此，应鼓励多学科交叉融合发展。异种移植走向临床将是人类医学发展从理念到应用的一次重大突破，将带动生物医疗新技术的发展，并催生新的生物、技术产业的崛起，我国应从战略层面布局，推进器官捐献和异种移植同步发展，为守卫国民健康做出努力。