蛛丝蛋白载药膜的结构表征及其降解性能研究

纪晨然，曾惠娜，刘欣欣，高鹏飞，赵 昱

（1.大理大学昆虫生物医药研发重点实验室，云南，大理 671000；2.大理大学药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心，云南，大理 671000；3.大理大学中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用协同创新中心，云南，大理 671000）

癌症患者化疗后容易出现白细胞减少，从而引起患者机体免疫功能下降，影响癌症病人的治疗进程，增加病人因感染而导致的死亡率[1]。化疗在一定程度上还会对包括口腔黏膜在内的一些正常组织和器官造成损伤，进而引发口腔黏膜炎（Oral Mucositis，OM），其发生率高达40%[2]。口腔黏膜炎是癌症患者放化疗后常见并发症之一，会严重影响患者的生活质量和对化疗的耐受性，因此，在肿瘤治疗中有必要治疗口腔黏膜炎。

美洲大蠊制备的药物康复新液已广泛应用治疗胃肠道溃疡[3]。康复新液是一种具有抗菌、抗病毒作用的中成药制剂，其作用是抑制蛋白质和RNA 的合成，从而降低了患者局部的炎症，促进黏膜损伤的愈合[4]。经研究发现，康复新液能够减轻口腔黏膜炎严重程度、减少口腔黏膜炎的发生率[5]，它是目前比较常用治疗OM 的药物之一。肌苷为细胞代谢改善类药物，可用于治疗心脏病、肝病、白血球减少症、血小板减小症、视神经萎缩、中心视网膜炎，能预防及降低由血防药物引起的对心脏或肝脏的副作用[6]。肌苷参与体内能量代谢及蛋白质合成，能提高各种酶（尤其是辅酶A 与丙酮酸氧化酶）的活性、且能使细胞在缺氧状态下继续代谢。有研究表明，该药可与其它药物联用，对治疗口腔溃疡具有较好的疗效[7]。

尽管康复新液单用或联用对口腔疾病防治疗效显著，但液体剂型易被口腔中唾液腺分泌的唾液冲走，有效成分难以在溃疡处长期停留。近年来载药膜剂通过药膜在黏膜表面附着可以在溃疡表面覆盖黏附，通过药物直接作用提高局部药物有效浓度。口腔膜剂提高了给药的方便性和患者顺应性，尤其对于有咀嚼和吞咽困难的儿童、老人和一些卧床患者，口腔膜剂可通过口腔黏膜或舌下组织快速吸收进入血液循环，避免了常规口服制剂的首过效应，提高了药物的生物利用度，适用于需要快速起效的一些急症[8-9]。

蜘蛛丝是蜘蛛丝素蛋白分子集束构成的动物蛋白纤维[10-11]，具有其它纤维不可比拟的强度大、弹性好、柔软、质轻、低免疫原性、疏水性、均匀性和生物相容性好等特点，在功能材料领域，尤其是医用材料方面极具潜力[12-13]，在药物输送方面也引起了关注。

因此，设计并制备出一款源于康复新药物、贴合于化疗性和放疗性口腔黏膜炎症及复发难愈型口腔溃疡患者，既方便携带、使用、更换而又不影响其口腔黏膜安全的缓释药膜十分必要，其要求是：一种能较长时间贴敷于口腔黏膜，且能持续缓慢释放出升高白细胞、提升免疫力、促进溃疡修复等功能药物之骨架载体，且该药物骨架载体是与口腔黏膜生物相容性好、不引起不良反应的天然生物骨架载药材料。肌苷是康复新含量较高的成分之一，其释出速率一定程度上也代表了康复新药物，因此选择以肌苷为模式分子，制备蛛丝蛋白膜，并对其表征及性能进行探究。

1 材料与仪器

敬钊缨毛蛛蛛丝（批号：20200312，海南蛛王生物科技有限公司）；胃蛋白酶（批号：P8390，Solarbio 生物科技有限公司）；六氟异丙醇（批号：20210325，上海钰康生物科技有限公司）；肌苷（批号：S18081，上海源叶生物科技有限公司）；盐酸（重庆川东化工有限公司）；六水合氯化镁（天津市风船化学试剂科技有限公司）；二水合氯化镁（西陇化工股份有限公司）；三水合磷酸氢二钾（国药集团化学试剂有限公司）；碳酸钾（国药集团化学试剂有限公司）；氯化钠（国药集团化学试剂有限公司）；氯化钾（天津市风船化学试剂有限公司）；溴化钾（天津市风船化学试剂有限公司）。

电子天平（EX224，奥豪斯仪器（上海）有限公司）；傅立叶变换红外光谱仪（Thermo Nicolet 5700 型，美国Thermo Nicolet 公司）；扫描电子显微镜（TESCAN MⅠRA，捷克TESCAN 公司）；数显恒温磁力加热搅拌器（RET B S025，德国ⅠKA 公司）；超声波清洗器（SK8200HP，上海科导超声仪器有限公司）；纯水仪（Direct-Q 8-UVR，德国Merck millipore 公司）；鼓风干燥箱（DHG-9240A，上海一恒科学仪器有限公司）；圆周型摇床（SK-O330-Pro，大龙兴创仪器有限公司）；综合药品稳定试验箱（SHH-SDT，重庆市永生实验仪器厂）；水接触角试验仪（SDC-200，东莞晟鼎精密仪器有限公司）；恒温振荡培养箱（MQD-S2R，上海旻泉仪器有限公司）；CCD 电子放大镜（韧跃1602，苏州安必信电子有限公司）；真空干燥箱（DZF-6021，上海一恒科学有限公司）；X 射线衍射仪（DX-2700BH，丹东浩元仪器有限公司）。

2 方法

2.1 载药蛛丝蛋白膜的制备

2.1.1 蛛丝蛋白溶液的制备

称取适量蛛丝，用水清洗多余杂质，将洗净的蛛丝于50 ℃烘箱中烘干，置干燥箱内放冷至恒重。称取干燥后的蛛丝800 mg，剪碎，置于1.0 L圆底烧瓶中，按质量体积比1:1（mg/mL）比例加入800 mL 六氟异丙醇溶剂（Hexafluoroisopropanol，HFⅠP），将盛有蛛丝-HFⅠP 共混液的圆底烧瓶置于恒温磁力搅拌器中，58 ℃，500 rpm 条件下进行冷凝回流，用400 目不锈钢筛网过滤，制备得到天然蛛丝蛋白液。将得到的天然蛛丝蛋白液在58 ℃，500 rpm 条件下进行冷凝回流浓缩，并回收HFⅠP。

2.1.2 蛛丝蛋白基质膜的制备

采用溶剂浇铸法，将2.1.1 中制得的蛛丝蛋白浓缩液趁热倒于平底玻璃皿中，并置于通风橱内的摇床上，以100 rpm 速率室温条件下快速挥干溶剂后成膜，回软揭膜，称量此蛛丝蛋白基质膜质量，记为M，塑封袋封存，4 ℃保存备用。

2.1.3 载肌苷蛛丝蛋白膜的制备

称取15%M 药物肌苷超声溶解在少量HFⅠP 中，快速倒入含蛛丝蛋白浓缩液的玻璃皿中，搅拌均匀后，置于摇床上，以100 rpm 速率在通风橱内室温干燥成膜后，回软揭膜得到载肌苷蛛丝蛋白膜，塑封袋密封4 ℃保存。

2.2 蛛丝蛋白膜的结构特征

2.2.1 水接触角测试（Contact Angle,CA）

将制备得到的膜剂裁剪成20 mm×50 mm 大小的钜形，放置于药品稳定试验箱（45 ℃，RH =50%）平衡48 h，再将其用双面胶固定在平整的载玻片上，采用水滴法测量，针头末端悬挂水滴体积为3 μL，在60 s 内观察并测量水滴在受试膜表面，达到平衡时水滴与受试膜之间的接触角。蛛丝蛋白基质膜、载肌苷蛛丝蛋白膜两种样品在不同位置重复测量3 次，取其平均值。

2.2.2 傅立叶红外光谱分析（Fourier Transform Infrared spectrometer,FTIR）

将肌苷、蛛丝、蛛丝蛋白基质膜和载肌苷蛛丝蛋白膜分别制备成粉末状，与溴化钾在玛瑙研钵中研磨，放入模具，压成薄片，得到各受试样品。测试扫描范围在4000 ～400 cm-1，分辨率选择4 cm-1，每个受试品扫描32 次[14]。

2.2.3 X-射线衍射分析（X-ray diffraction,XRD）

将蛛丝蛋白基质膜、载肌苷蛛丝蛋白膜放在载物台上固定后直接测试，肌苷粉末用载玻片压平，使其表面平整后测试。实验中设置管电压40 kV，管电流30 mA，扫描速度为4°/min，扫描角度2θ=5 ～60°[15]。

2.2.4 扫描电镜观察膜剂形态（Scanning Electron Microscope,SEM）

将制备得到的蛛丝蛋白基质膜和载肌苷蛛丝蛋白膜裁50 mm×50 mm 面积大小的样品，用导电胶粘在试样台上做喷金处理，观察膜的表面形态。

2.3 体外模拟膜剂的降解性能

将制备得到的蛛丝蛋白基质膜和载肌苷蛛丝蛋白膜置于真空干燥箱内干燥至恒重，称量10 mg左右的各样品膜剂，记为m0。各膜剂在每种降解液中做三组平行降解实验。

根据GB/T18886-2019[16]标准中的方法配制人工唾液，具体成分如表1。

表1 人工唾液成分表Table 1 Composition of artificial saliva

根据2020 年版《中国药典》四部0921 崩解时限检查法附录[17]中的方法配制人工胃液，具体过程如下：取稀盐酸16.4 mL，加水约800 mL 与胃蛋白酶10 g，摇匀后，加水稀释成1000 mL，即得人工胃液。

将蛛丝蛋白基质膜和载肌苷蛛丝蛋白膜样品各自装于3 个离心管中，各添加2 mL（37±0.5）℃新鲜配制的人工唾液，将离心管置于恒温振荡培养箱中，以37 ℃，100 rpm 的条件进行降解实验。于人工唾液中降解7 d，每隔24 h 从离心管中取出样品，干燥至恒重后称量其质量，记为mt。每隔24 h 更换等温等体积新鲜配制的人工唾液，直至实验结束。

为了模拟其在胃中降解，选择溶出试验仪，将称量好的蛛丝蛋白基质膜和载肌苷蛛丝蛋白膜分别放入转篮中，将配置好的人工胃液各加入100 mL至转篮所对应的烧杯，设置转速为100 rpm，水浴温度为37 ℃。在人工胃液中降解3 d，分别在第1、3、6、18、36、72 h 取出样品，干燥至恒重后称量其质量，记为mt，每隔8 h 更换等温等体积新鲜配制的人工胃液直至实验结束。通过高倍CCD（Charge Coupled Device)电子放大镜观测膜表面形貌的降解情况，由m0和mt可以计算出质量损失率，由此推断出降解情况。按照公式1.1 计算并绘制降解曲线。

D：在不同降解时间内膜的降解率(%);m0：降解实验前各样品恒重的质量(mg)；mt在不同降解时间点各样品干燥至恒重的质量(mg)。

3 结果

3.1 膜剂的结构表征

3.1.1 膜剂的水接触角不同膜剂的接触角测量如图1 所示，从图1 和表2 可看出，膜剂的水接触角均小于90°，表现出较好的亲水性。当加入药物肌苷后，水接触角有所降低，可能是因为肌苷在水中略溶，增加了载肌苷蛛丝蛋白膜的亲水性。

表2 各膜剂水接触角测试结果Table 2 Test results of water contact angle of each film agent

3.1.2 FTIR

如图2 所示，（a）天然蛛丝和（c）蛛丝蛋白基质膜在1700 ～1600 cm-1均有酰胺Ⅰ带的吸收，其为α螺旋结构，但蛛丝蛋白基质膜的酰胺Ⅰ带羟基峰较宽、吸收较强，可能是因为分子侧链上羟基之间形成了氢键；天然蛛丝与蛛丝蛋白基质膜在1561 cm-1、1516 cm-1（酰胺Ⅱ带），1227 cm-1、1219 cm-1（酰胺Ⅲ带）均有酰胺基团的特征吸收，但蛛丝蛋白基质膜在酰胺Ⅱ带和Ⅲ带的吸收向着长波方向移动，可能是因为HFⅠP 是高极性溶剂，通过诱导使其吸收发生红移。图中（d）载药蛛丝蛋白基质膜出现了（b）药物肌苷在1709 cm-1（C=O伸缩）的特征吸收峰，载药蛛丝蛋白膜还在酰胺Ⅰ带中出现1619 cm-1和酰胺Ⅲ带出现1224 cm-1（CO-C）的新吸收峰。综上可推测出，肌苷与蛛丝蛋白膜之间存在相互作用力，药物可负载于蛛丝蛋白膜中。

图2 天然蛛丝、蛛丝蛋白基质膜、肌苷与其载药蛛丝蛋白膜的FTⅠR 图谱Fig.2 FTⅠR spectra of natural spider silk,inosine and its drug loaded arachnoid protein film

3.1.3 XRD

XRD 的结果由图3 所示，（a）肌苷粉末的衍射角（2θ）在10～30°之间有尖锐的结晶衍射峰，表明肌苷为结晶态化合物；此结果与相关文献报道一致[14]；（b）蛛丝蛋白基质膜的主衍射峰在21.8°，并在10.5°出现中等强度的衍射峰；（c）载肌苷蛛丝蛋白膜与（b）蛛丝蛋白基质膜相比在2θ=10.5°特征衍射峰增强，这表明药物肌苷可能有一部分以结晶态形式分散在膜中，综上推测肌苷与蛛丝蛋白基质膜之间产生相互作用力，该推测也与红外的表征分析结果一致。

图3 蛛丝蛋白基质膜、肌苷及其载药蛛丝蛋白膜XRD 图谱Fig.3 XRD pattern of inosine and its drug loaded spider silk protein film

3.1.4 SEM

蛛丝蛋白基质膜与载肌苷蛛丝蛋白膜表面形貌结果如图4 所示，从图a1、a2 可以看出制备的蛛丝蛋白基质膜具有三维多孔结构，膜的孔洞圆滑、分布均匀，膜的骨架孔隙间呈空心或实心的虚抛状纤维丝，形成的膜孔朝向不一，其最大膜孔与最小膜孔大小比例不超过10 倍。图b1 和b2为不同倍数下载肌苷蛛丝蛋白膜电镜图，可见膜表面出现纵横交错的纤维丝，直径在0.2 ～0.5 μm之间；膜表面的隆起部分出现不规则片状物，推测可能是分布在膜表面的药物肌苷，在HFⅠP 溶液中溶解度很好的肌苷除了镶嵌在膜内和膜纤维外，其余的凝结成分子簇状/片状体外挂于膜孔之间。

图4 膜剂在不同放大倍镜下的SEM 图Fig.4 SEM of film agent under different magnifications

3.2 体外模拟膜剂在人工液体中的降解

图5 为膜剂在人工唾液中的降解曲线，由图5可知在人工唾液中第1 d，各膜剂质量均发生不同程度降低，可能是由于在成膜后，膜上有较为松散的膜碎片经溶液浸泡后脱落引起。蛛丝蛋白基质膜在此后6 d 质量变化相差不大，但载肌苷蛛丝蛋白膜在第1 d 的降解实验所得质量与蛛丝蛋白基质膜相比，质量变化幅度比较大，考虑可能是膜中药物的释放所引起的，随着溶剂进入膜内，膜孔逐渐暴露，使得药物逐渐释放，在第4 d 载肌苷蛛丝蛋白膜在人工唾液中的质量变化明显变缓，其最后的质量变化在20%左右，参照图7 中（A2/B2）可看出各膜剂在人工唾液中7 d 相对稳定，因此推测其质量改变部分与单位面积内所载药物释出相关。

图5 各膜剂在人工唾液中的降解率曲线Fig.5 Degradation weight loss curve of each film agents in artificial saliva

图6 的降解失重曲线显示各膜剂在人工胃液72 h 内均发生较大程度的降解，其降解率均大于50%，从图7 中（A3/B3）中可观察到明显的孔洞，这可能与人工胃液中胃蛋白酶的作用有关。

图6 各膜剂在人工胃液中的降解率曲线Fig.6 Degradation weight loss curve of each films in artificial gastric juice

图7 膜剂在2 种降解液中的CCD 相机镜下降解观察结果图（7.5×）Fig.7 CCD camera microscope degradation observation of film agent in two degradation solutions

综上可以得出，蛛丝蛋白膜作为口腔膜剂，在口腔内不易被溶蚀降解，可在较长时间内保持稳定，进入胃中后可在胃中降解，即使在使用过程中因偶然因素将此载药膜误服吞咽，也不易造成消化道阻塞。

4 讨论

本研究试验设计并制备出一款源于康复新药物、适用于放化疗口腔黏膜炎，方便患者日常携带、使用、更换且具有安全性的药膜。将肌苷药物分子与蛛丝蛋白均匀混合，采用溶剂浇铸法制备蛛丝蛋白基质膜和载肌苷蛛丝蛋白膜，利用CA、FTⅠR、XRD、SEM 对其内部结构进行表征并研究其降解性能。结果表明：各膜剂具有一定亲水性，蛛丝蛋白基质膜呈三维多孔结构，膜表面分布着纤维线状结构，载肌苷蛛丝蛋白膜膜孔之间可见纤维连接的片状物，与基质膜表面形貌相差较大，证实蛛丝蛋白膜可成功载入药物，XRD 显示药物多以晶体形态存在于膜中；另外，体外降解实验证明各膜剂在人工唾液中稳定存在7 d，可进一步挖掘其作为口腔膜剂长期缓释材料的可能；在人工胃液中72 h 发生较大程度的降解，3 d 内降解达到65%左右，此实验表明即使因误食等原因导致膜剂进入体内，膜剂也会经过胃液消化降解而排出体外。

本试验仅对敬钊缨毛蛛的天然蛛丝制备出的蛛丝蛋白膜，作为药物缓释载体的可能性进行初步研究，通过一系列表征和评价，对探索其作为口腔缓释膜剂的可能性做了基础研究。蛛丝蛋白可与其它如石墨烯等生物相容材料联合应用，或采用其它如3D 打印技术开发出更多有价值应用。

综上所述，利用溶剂浇铸法创新性地制备出载肌苷药物的蛛丝蛋白膜，其作为一种口腔膜剂，为辅助治疗口腔溃疡患者提高其白细胞含量以及开发载肌苷药物的口腔膜剂等系列医药产品提供参考价值。