山羊口疮病毒四川株007基因克隆及其编码蛋白分析

张风雨，杨 璐，姜雯玉，黄 忍

（成都威斯津生物医药科技有限公司，四川 成都 610218）

羊口疮病毒（ORFV）是痘病毒科、脊椎动物痘病毒亚科、副痘病毒属的典型代表［1］。ORFV具有高度的嗜上皮性，主要通过破损的皮肤及黏膜感染，是一种引起绵羊、山羊及人发病的急性高度接触性人兽共患病［2］。临床上主要以感染动物的唇、鼻孔、口腔黏膜、乳房、阴部等部位皮肤形成红斑、水疱、脓疱、丘疹和疣状痂皮为特征［3］。已有研究表明，羊口疮病毒为线性双链DNA 病毒，基因组大小为134～139 kb，其中包含末端基因区（ORFs001-008和112-134）和中间核心区（ORFs009-111），编码134个基因［4］。早有研究报道ORFV 编码dUTPase［5］，dUTPase 由ORFV中483 bp的基因序列编码产生，该蛋白常以融合形式表达［6］。dUTPase 是一种普遍存在的酶，它催化dUTP 水解生成脱氧尿苷单磷酸（dUMP）和焦磷酸（PPI），从而降低细胞中dUTP/dTTP 的比值，阻止尿嘧啶进入DNA，降低发生错配的几率［7］。dUMP经甲基化变为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸（dTTP），dTTP 是胸腺核苷酸生物合成的前体。研究表明，当胞内dUTPase 酶活性不足以支持病毒进行有效复制时，编码dUTPase 基因的病毒则可以上调胞内dUTPase 酶活性，确保病毒正常复制［8］。本研究对山羊口疮病毒四川分离株007基因（dUTPase）进行PCR扩增、克隆，并利用生物信息学软件对该基因编码的蛋白结构进行预测，为进一步研究ORFV dUTPase蛋白在ORFV致病中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 山羊口疮病毒四川分离株SC-LZ1和pET-32a（＋）载体由西南民族大学动物医学实验室保存；DNA提取试剂盒、PCR试剂、胶回收试剂盒、Plasmid DH5α感受态细胞购至Takara 公司；限制性内切酶BamHI和XhoI购自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 ORFV 007基因的扩增 根据GenBank 中ORF strain SJ1（KP010356.1）dUTPase 基因序列，用Primer 5.0 软件设计一对带有酶切位点的特异性引物。上游引物：5′-CGCGGATCCATGGAG TTCTGCTGCACG-3′，下游引物：5′-CCGCTCGAG TTAAAGAGCTACATTTTACAATTTTGAT-3′。预期目的基因片段大小为507 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根据DNA 提取试剂盒说明提取山羊口疮病毒四川分离株SCLZ1 的DNA。按以下体系进行基因扩增：DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，PreMix 酶12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，反应体系总体积为25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min；16 ℃保存。

1.2.2 pET-32a（＋）-007重组质粒的构建 将所扩增的目的基因经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，采用胶回收试剂盒对目的条带进行胶回收。分别用限制性内切酶BamHI 和XhoI 对胶回收产物和pET-32a（＋）进行双酶切（双酶切体系见表1）。在37 ℃水浴条件下酶切30 min，酶切产物采用纯化试剂盒进行纯化回收。将酶切纯化产物与pET-32a（＋）在16 ℃金属浴中连接过夜（连接体系见表2）。连接产物转化入DH5α感受态细胞，再均匀涂布于含100 μg/mL AMP 的LB 平板上，再倒置于37 ℃恒温培养箱中过夜。次日，挑取疑似阳性单菌落至含有100 μg/mL AMP的LB液体培养基内，37 ℃160 r/min 增菌培养过夜。采用Plasmid Miniprep Kit质粒提取试剂盒提取质粒，对质粒进行PCR 鉴定和双酶切鉴定。将鉴定结果为阳性的质粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序结果为阳性的质粒命名为pET-32a（＋）-007。

表1 双酶切体系

表2 连接体系

1.2.3 ORFV 007基因序列分析 将测序所得序列在NCBI上进行同源性比较，并利用Mega7.0构建系统进化树。

1.2.4 dUTPase蛋白结构及功能预测 采用在线软件ExPasy 服务器上ProtParam 工具对基因编码的氨基酸序列进行理化性质分析；利用ExPasy服务器的ProtScale工具，计算基于K-D法的蛋白质疏水性；使用TMHMM Server v.2.0进行跨膜区分析；使用Signal P 3.0 server 进行信号肽预测；利用NPSA和CBS在线软件对该蛋白进行二级结构预测；利用NCBI 在线软件对蛋白保守域进行分析进而预测其功能；利用SWISS-MODEL 进行同源建模，预测其三级结构。

2 结果

2.1 ORFV 007 基因的扩增 以提取的山羊口疮病毒四川分离株SC-LZ1的DNA为PCR扩增模板，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果成功扩增出约500 bp条带，与预期扩增条带大小相符（图1）。

图1 ORFV 007 PCR扩增结果

2.2 重组质粒的双酶切鉴定 由图2可知，重组质粒双酶切产物与预期结果相符。

图2 pET-32a（＋）-007重组质粒的双酶切鉴定

2.3 ORFV 007基因序列分析

2.3.1 ORFV 007 基因全序列 ORFV 007 基因全长为483 bp，测序结果显示扩增基因无缺失。

2.3.2 ORFV 007基因的遗传进化树 将本研究扩增测序的ORFV 007 基因与NCBI 上收录的所有ORFV 007 基因进行比对分析，并构建遗传进化树。结果该基因全序列与NCBI 收录的编号为MF4890951 基因的同源性最高，达98.96%；构建的系统进化树结果显示本试验分离毒株 与 MF489089.1、MF489095.1、MF489093.1、MF489088.1、MF489090.1 及MF489094.1 在同一分支，说明亲缘关系较近，但又单独为一小支，存在一定的变异（图3）。

图3 ORFV 007基因序列系统进化树

2.4 ORFV 007 编码的dUTPase 蛋白结构预测利用ExPasy 服务器上的ProtParam 工具对该蛋白进行理化性质分析，结果显示：ORFV 007 编码161个氨基酸，相对分子量为16 945.11，理论PI值为5.27，消光系数为11 960，不稳定系数为21.53，脂肪系数为82.19，总平均亲水性为－0.016；该蛋白包含了除Pyl 和Sec 两个氨基酸之外的其余18种常见氨基酸，其中Gly 含量最高，为13.1%，Met和Trp 含量最低，均为0.6%，其他氨基酸含量在1.9%～9.4%；带正电荷氨基酸残基总数为14 个，带负电荷氨基酸残基总数为18 个。利用ExPasy的ProtScale 程序计算基于K-D 法的蛋白质疏水性，结果未发现典型疏水区域。使用TMHMM Server v.2.0进行跨膜区分析，结果未发现典型跨膜区域。使用Signal P 3.0 server 进行信号肽预测，结果显示此蛋白不存在信号肽，不是分泌蛋白。二级结构预测显示ORFV 007编码蛋白主要由无规卷曲和延伸链构成，其中无规卷曲含量最多，为60.62%，位于1-7、14-33、35-46、57-61、67-71、80-82、86-90、99-103、107-110、120-124、130-154、160 区域；延伸链结构占蛋白质的33.12%，位于8-13、34、47-56、62-66、72-79、83-85、91-98、104-106、125-128、155-159区域；除上述结构外，还有少部分α螺旋结构，占蛋白质的5.62%，位于111-119 区域。CBS 在线预测显示，此段蛋白质存在12 个磷酸化位点（丝氨酸9 个、苏氨酸2个、酪氨酸1个）；在第17位氨基酸位置，含有一个潜在的N-连接糖基化位点；NCBI 在线预测显示，此蛋白质保守域活性位点的保守特征由9个氨基酸残基组成，这9个残基分别位于65-75、80-95区域；此段蛋白三聚体界面的保守特征由29 个氨基酸残基构成，分别位于25-50 和80-115 区域；dUTPase 蛋白氨基酸序列中包含五个保守结构域，分别是PHA02703、dut、dUTPase、Dut、trimeric_dUTPase。用SWISS-MODEL 预 测该蛋白三级结构（图4），QMQE为0.77，QMEAN为0.31，与模板3ehw.1.A 氨基酸序列的相似性为70.21%，属于dUTP焦磷酸酶。

图4 dUTPase蛋白三维结构预测图

3 讨论与结论

3.1 讨论 dUTPase 广泛存在于各类哺乳动物、昆虫、植物、细菌以及病毒内，对生物体生命发展有重要意义。ORFV dUTPase 是dUTPase 超家族中的常见成员，与参与催化dUTP转化为dUMP过程中的其他超家族成员相比，dUTPase 与它们具有相同的四级结构，但在合成dTTP 过程中，仅有dUTPase 可以通过转储制作将dUTP 转化为dUMP［9］，并且还能消除过量dUTP，从而降低dUTP与dTTP比例，进一步降低尿嘧啶的DNA合成过程，减少在合成过程中出现错配［7］。除上述已经确定的功能外，已有研究暗示dUTPase 可调节病毒毒力和基因组完整性［10］；亦有研究表明病毒dUTPase 在调节宿主免疫中起着重要作用，可促进Ι型干扰素（IFN）的生成［11］。

3.2 结论 本试验以山羊口疮病毒四川分离株SC-LZ1 的DNA 为模板，采用自行设计的ORFV dUTPase 特异性引物，经PCR 成功扩增获得dUTPase 完整基因，通过构建pET-32a（＋）-007重组表达质粒并测序分析，发现该基因全序列与NCBI 收录的编号为MF4890951 的基因同源性最高，为98.96%；构建的系统进化树显示该分离毒株 与 MF489089.1、MF489095.1、MF489093.1、MF489088.1、MF489090.1 及MF489094.1 在同一分支，说明亲缘关系较近，但其又单独为一小支，存在一定的变异。利用各类生物软件对该蛋白结构进行分析，结果编码蛋白中Gly含量最高，且二级结构中无规卷曲所占比例最大；在蛋白质二级结构中，就结构稳定性而言，α螺旋＞β折叠＞无规卷曲，但就功能而言，无规卷曲往往充当蛋白质和酶的活性中心，综合对蛋白活性位点的预测分析，推测其酶活性中心位于氨基酸序列65-75及80-95；疏水性区域预测结果显示此段氨基酸无疏水性区域，氨基酸疏水性预测值越大则此段氨基酸含有跨膜区域的可能性越大，跨膜区预测结果也显示此段氨基酸无跨膜区域，所以跨膜区分析结果与疏水性区域分析结果一致，进一步证明该蛋白不是细胞信号传导有关的膜受体蛋白。