健肝乐颗粒质量评价

张东方，鲁晓光

（南阳市产品质量检验检测中心，河南 南阳 473000）

健肝乐颗粒源于东汉张仲景《伤寒论·太阳篇》，由白芍、甘草组成，为经典名方发展而来的现代制剂。该组方具有养血护肝，解毒止痛的功效。具有降低转氨酶，消褪黄疸以及改善各类肝炎临床症状的作用，临床用于治疗急慢性病毒性肝炎。现执行标准［1］中无含量测定项，无法满足中药现代化的发展需求。目前，该复方制剂研究主要集中在临床方面［2-5］，其质量控制研究［6］较少。且目前尚未见有关健肝乐颗粒指纹图谱及化学模式识别的研究报道。在查阅文献［7-14］ 的基础上，发现该制剂虽然只有2 味药材，但化学成分多而复杂。本实验以中药指纹图谱结合聚类分析（HCA） 方法、主成分分析法（PCA） 以及正交偏最小二乘判别分析法（OPLS-DA） 将指纹图谱提供的信息进行再评价。再根据不同入血成分保肝作用强弱不同，再经过实验筛选，选取芍药中没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷，甘草中甘草苷、芹糖甘草苷、异甘草苷、甘草酸铵作为指标成分，以期为提高健肝乐颗粒的质量标准提供依据，为优化生产工艺达到药效最佳提供基础。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；BP211D 型电子天平（德国赛多利斯公司）； WT-1200 型超声波清洗器（济宁万通超声仪器设备厂）。异甘草苷（批号17042102，纯度98%）、芍药内酯苷（批号19121705，纯度99.28%）、芹糖甘草苷（批号20081705，纯度98%）对照品（成都普菲德生物技术有限公司）； 芍药苷（批号110736-201539，纯度96.4%）、甘草酸铵 （批号110731-202021，纯度96.2%）、没食子酸 （批号110831-200803，纯度 90.1%）、甘草苷 （ 批号 111610-201908，纯度92.0%） 对照品（中国食品药品检定研究院）。健肝乐颗粒购于武汉康乐药业有限公司，批号1322014、1323014、1322004、1323003、1323002、1322008、1220037、1222036、1222035、1222061、1322013、1322008、1323001、1323002、1220035、1220034，编号S1 ～S16，其中S1 ～S6、S11 ～S14 规格为15 g/袋，含蔗糖； S7 ～S10、S15～S16 规格为6 g/袋，无蔗糖。白芍、甘草购于市场，经南阳市产品质量检验检测中心鲁晓光副主任药师鉴定为正品。甲醇、乙腈均为色谱纯（美国GIOVINI Chemical 公司）； 水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Welchrom C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈（A） -0.3%磷酸（B），梯度洗脱（0 ～10 min，10% ～20% A； 10 ～22 min，20% A； 22 ～35 min，20% ～40%A； 35～50 min，40%A）； 体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃； 检测波长230 nm； 进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、芹糖甘草苷、异甘草苷、甘草酸铵对照品适量，甲醇溶解并稀释，制成质量浓度分别为25.21、24.71、92.84、11.86、12.69、3.74、46.95 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取本品适量，混匀研细，精密称取0.5 g （S7～S10 各取0.2 g），精密加入25 mL 甲醇，称定质量，超声提取30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，即得。

2.2.3 阴性样品溶液制备 按处方和工艺，分别制备缺白芍、缺甘草的阴性样品，按 “2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取本品（S1） 适量，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得各成分相对保留时间、相对峰面积（以峰8甘草苷为参照） RSD 均小于1.9%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取本品（S1） 适量，按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得各成分相对保留时间、相对峰面积（以峰8 为参照） RSD 均小于1.7%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取本品（S1） 适量，按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得各成分相对保留时间、相对峰面积 （以峰8 为参照） RSD 均小于2.0%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4 HPLC 指纹图谱建立

2.4.1 图谱生成 取16 批样品，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012） ”，设置S1为参照，时间窗宽度为0.3 min，生成方法为中位数法，全峰匹配结合多点校正，得到共有指纹图谱和对照指纹图谱（R），见图1A。通过与对照品色谱图（图1B） 比对，确认峰1 为没食子酸，峰4 为芍药内酯苷，峰5 为芍药苷，峰7 为芹糖甘草苷，峰8 为甘草苷，峰15 为异甘草苷，峰20 为甘草酸铵，并选取分离度好、峰面积稳定、保留时间适宜的甘草苷（峰8） 作为参照峰。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.4.2 色谱峰归属 依据单味药材、对照品溶液的紫外光谱信息和保留时间进行比对，结果见图1C～1D。由此可知，色谱峰1～5、9～10 归属于白芍，6～8、11～21 归属于甘草。

2.4.3 相似度评价 16 批样品与对照指纹图谱的相似度分别为0.986、0.985、0.996、0.996、0.995、0.996、0.974、0.992、0.991、0.989、0.985、0.985、0.997、0.997、0.985、0.992，表明不同批次、工艺样品成分组成基本一致，质量均一性良好。

2.5 化学模式识别

2.5.1 聚类分析 （HCA） 采用SPSS 26.0 软件，以Euclidean 距离为度量标准，通过组间对比法，以16 批样品共有峰峰面积与相对峰面积为变量进行系统聚类［15-20］，结果见图2。由此可知，以共有峰面积为变量时，16 批样品聚为2 类，S1 ～S6、S8、S9、S11 ～S14、S16 为一类，S7、S10、S15 为一类，表明它们在成分含量上整体一致，但也具有一定的差异性，可能与生产工艺、投料量不同有关，但总体上不大； 以相对峰面积为变量时，16 批样品可聚为2 类，S1～S5、S7～S16 为一类，S6 为一类。综上所述，不同批次、规格、剂型样品成分组成相似度高，质量稳定可靠。

图2 16 批健肝乐颗粒聚类分析图

2.5.2 主成分分析（PCA） 采用SIMCA 14.0 软件对16批样品共有峰峰面积进行PCA 分析，结果见图3A。由此可知，21 个共有峰分成4 个主成分，16 批样品分为2 类，S1～S6、S11～S14 为一类，S7～S10、S15～S16 为一类。

图3 16 批健肝乐颗粒OPLS-DA 分析图

2.5.3 正交偏最小二乘判别分析 （OPLS-DA） 采用SIMCA 14.0 软件对16 批样品进行OPLS-DA 分析，结果见图3。由此可知，VIP 大于1 的成分有11 种，峰号分别为5～9、11、13、15、16、18、21；R2Y为0.992，Q2为0.977，均不小于0.50，表明模型稳定性、预测性良好［19-23］； 经200 次置换检验后Q2回归线与纵轴的相交点小于零，表明模型不存在过拟合，可用于预测分析。

2.5.4 指标成分筛选 中药质量标志物［21］（Q-marker） 可反映中药安全性和有效性，并能进行定性定量分析。研究中药质量标志物可提高质量一致性、可控性和溯源性，更好地控制中药生产过程、进行质量监管。本实验根据文献［7-14］ 报道及上述结果，确定没食子酸（峰1）、芍药内酯苷（峰4）、芍药苷（峰5）、芹糖甘草苷（峰7）、甘草苷（峰8）、异甘草苷（峰15）、甘草酸铵（峰20） 作为指标成分。

2.6 指标成分含量测定 采用HPLC 法。

2.6.1 溶液制备 同“2.2” 项。

2.6.2 色谱条件 同“2.1” 项。

2.6.3 系统适用性考察和专属性试验 取对照品、供试品（S1）、阴性样品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各指标成分分离度符合要求，理论塔板数均大于4 000，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.6.4 线性关系考察 分别取对照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表1，可知各指标成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各指标成分线性关系

2.6.5 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、芹糖甘草苷、异甘草苷、甘草酸铵峰面积RSD 分别为1.8%、1.6%、1.0%、0.41%、0.92%、1.8%、1.2%，表明仪器精密度良好。

2.6.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液（S1），于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、芹糖甘草苷、异甘草苷、甘草酸铵峰面积RSD 分别为2.0%、0.82%、1.4%、1.3%、1.1%、2.0%、2.0%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6.7 重复性试验 取供试品溶液（S1） 6 份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、芹糖甘草苷、异甘草苷、甘草酸铵含量RSD 分别为1.5%、1.4%、0.9%、2.0%、0.9%、0.5%、1.1%，表明该方法重复性良好。

2.6.8 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的样品（S1） 0.25 g，共6 份，加入对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、芹糖甘草苷、异甘草苷、甘草酸铵平均加样回收率分别为98.41%、97.51%、96.13%、95.59%、96.16%、97.62%、98.09%，RSD 分别为2.0%、1.9%、1.3%、1.6%、1.1%、1.1%、1.1%。

2.6.9 测定方法 取出16 批样品内容物，混匀后研细，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 各指标成分含量测定结果（mg/袋，n＝3）

3 讨论

3.1 提取方法选择 先进行了提取溶剂的筛选实验，结果表明在甲醇溶液中，待测成分提取较充分。进一步考察提取方式，分别比较了加热回流30、120、150 min 及超声处理30、40、60、90 min，结果显示甲醇超声处理30 min 时目标成分有效溶出。

3.2 色谱条件考察 考察了不同流动相，包括乙腈-水、甲醇-0.3%磷酸、乙腈-0.3% 磷酸、乙腈-0.3% 甲酸，发现乙腈-0.3%磷酸梯度洗脱时分离效果良好，保留时间适宜，色谱峰峰形佳。通过紫外扫描，发现7 种成分分别在258、230、360 nm 处得到最大吸收，230 nm 处7 种成分均有较强的紫外吸收，且基线最稳定。通过与文献［22-26］ 及本实验比较，发现波长切换法和230 nm 单波长测出的结果差异不大，考虑到基线稳定性和重复性，选择230 nm 作为检测波长。

3.3 指纹图谱在复方中药制剂分析中的应用及其作用 中药质量影响因素包括植物种属、采收期、栽培区域、贮藏条件、加工工艺等，进而造成成分差异，使其药理活性及临床应用也存在差异，并使中药质量控制及评价成为复杂难题。指纹图谱能够与中医“整体” 的传统理论呼应，将多指标成分定量法与指纹图谱结合，同时提供定性和定量信息，将是一种更适合、更有吸引力的用于复方中药制剂的分析方法，能更好地揭示不同厂家批次间中药制剂的细微差异。

在指标成分筛选过程中发现，该色谱系统还可同时分离测定芍药、甘草中另外几种具有保肝作用的指标成分丹皮酚、槲皮素、异鼠李素，但在该制剂中含量过低，暂不进行定量研究。中药现代化的发展离不开对有效成分量效关系的深入研究，经典名方尤其应注重多组分的含量研究，以改进生产工艺，使制剂疗效达到最佳。