冠心生脉丸质量标准提升

2024-03-25刘静玉金武燮谷丽华吴立宏王峥涛

中成药 2024年3期

刘静玉，金武燮，谷丽华，2，吴立宏，2*，王峥涛，2*

（1.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，国家中医药管理局中药新资源与质量评价重点实验室，上海 201203； 2.上海中药标准化中心，上海 201203）

我国中成药产业发展迅速，目前临床应用的品种已达九千余个［1］。但随着中药市场化的高速发展，加之资源短缺等问题，导致部分中成药出现低限投料或少投料、使用近似品种掺加投料等影响质量的问题［2］，含贵细药材者尤为突出，从而影响其临床有效性和安全性［3-4］。

冠心生脉丸收录于《中华人民共和国卫生部颁药品标准（中药成方制剂第六册）》，由人参、麦冬、五味子（醋炙）、丹参、赤芍、郁金、三七7 味药材组成［5］。方中人参为君药，性甘温，益元气，补肺气，生津液；三七与丹参、赤芍、郁金活血化瘀，扩张冠脉，其中郁金疏肝为气中之血药，三七祛瘀为血中气药，气行血调而痛可自止［6］，临床上用于治疗心气不足、心阴虚弱引起的心血瘀阴、心悸气短、胸闷作痛、自汗乏力、脉微结代，冠心病、心绞痛、心律不齐等疾病［7-10］。但该制剂现行质量标准只有赤芍、丹参的定性鉴别，目前报道也大多为丹参、赤芍所含成分的含量测定［11-14］，而人参和三七作为方中贵细药材，尚无定性定量评价方法，不利于其质量控制［15-16］。因此，本实验以人参和三七为研究对象，建立TLC 定性鉴别和HPLC 含量测定方法，以期提升冠心生脉丸质量标准，有助于该制剂临床疗效稳定。

1 材料

1.1 仪器 Automatic TLC Sampler-4 薄层色谱全自动点样仪（瑞士CAMAG 公司）； Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）； BSA323S 电子天平（千分之一，德国Sartorius 公司）； AE200 电子天平［万分之一，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］； BT25S 电子天平（十万分之一，德国Sartorius 公司）； SF-TGL-16M 离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）； M5800 超声波清洗机（美国Branson 公司）； Accucore-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，2.6 μm）（美国Thermo Fisher Science 公司）；Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）（美国 Agilent 公司）； Waters CORTECS C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）（美国Waters 公司）； TLC Silica gel 60 硅胶预制薄层板（批号HX066475，德国Merck 公司）；银龙GF254高效硅胶预制薄层板（批号20180310，烟台市化学工业研究所）； G 型高效硅胶板（批号20170209，青岛海洋化工厂分厂）； DCFertigplatten DURASIL-20 硅胶预制薄层板（德国MN 公司）。

1.2 试剂与药物人参（批号120917-201712）、三七（批号120941-201810）对照药材及人参皂苷Rg1（批号110703-202034）、人参皂苷Re （批号110754-202129）、人参皂苷Rb1（批号110704-202129）、人参皂苷Rd （批号111818-202104）、人参皂苷Rf （批号111719-201806）、三七皂苷R1（批号110745-201921）、拟人参皂苷F11（批号110841-202108）对照品均购自中国食品药品检定研究院。

人参（批号210325）、麦冬（批号210622）、五味子（批号210710）、丹参（批号210603）、赤芍（批号210416）、郁金（批号210515）、三七（批号210721）均由上海康桥中药饮片有限公司提供，经上海中医药大学中药研究所吴立宏研究员鉴定为正品，符合2020 年版《中国药典》一部规定［7］。冠心生脉丸共13 批（编号G1～G13），其中G1～G4 来自厂家1，G5～G8 来自厂家2，G9 ～G11来自厂家3，G12～G13 来自厂家4，组方药材人参9 g、麦冬9 g、五味子（醋炙） 3 g、丹参15 g、赤芍12 g、郁金9 g、三七粉0.6 g，制备方法为除三七粉以外其余6 味药材粉碎成细粉，与三七粉配研，过筛，混匀，每100 g 粉末加90 ～110 g 炼蜜，制成大蜜丸，即得。

乙腈为色谱纯（美国Fisher 公司）；甲醇等其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 TLC 定性鉴别

2.1.1 供试品溶液制备取本品4 g，加2 g 硅藻土研细，加25 mL 乙酸乙酯超声提取30 min，弃去提取液，加25 mL 水饱和正丁醇超声提取30 min，取上清液，加氨试液洗涤3 次，每次50 mL，加25 mL正丁醇饱和水洗涤，取正丁醇层蒸干，加10 mL水超声溶解，经D101 大孔树脂（内径1.5 cm，柱高15 cm），加150 mL 水洗脱，弃去水液，150 mL 35%乙醇洗脱，弃去洗脱液，150 mL 40%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加2 mL甲醇溶解，过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.1.2 对照品溶液制备精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rf 及三七皂苷R1、拟人参皂苷F11对照品适量，甲醇溶解，制成质量浓度分别为0.507、0.504、0.499、0.501、0.503、0.500 mg/mL 的溶液，即得。

2.1.3 对照药材溶液制备取人参、三七对照药材各1 g，按“2.1.1” 项下方法制备，即得。

2.1.4 阴性样品溶液制备按处方和工艺，分别制成缺人参、缺三七、缺人参和三七的阴性样品，按“2.1.1 ” 项下方法制备，即得。

2.1.5 结果分析按照2020 年版《中国药典》四部通则0502，分别吸取供试品、阴性样品溶液各8 μL，人参对照药材溶液4 μL，三七对照药材溶液1 μL，对照品溶液1 μL，点于同一硅胶薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13 ∶7 ∶2） 10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加热至斑点显色清晰，在可见光下检视，结果见图1～2。表明正品供试品色谱在对照药材、对照品色谱相应位置上显示相同颜色斑点，未检出拟人参皂苷F11，阴性样品色谱相应位置无干扰。

图1 专属性试验TLC 色谱图Fig.1 TLC chromatogram of specific tests

图2 13 批样品TLC 色谱图Fig.2 TLC chromatogram of thirteen batches of samples

2.2 HPLC 含量测定

2.2.1 供试品溶液制备取本品约4 g，精密称定，加2 g 硅藻土研细，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 水饱和正丁醇，称定质量，超声（功率300 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷，水饱和正丁醇补足减失的质量，摇匀，取上清液20 mL，用20 mL 氨试液洗涤，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液制备精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，制成质量浓度分别为1.014、1.008、1.006、0.998 mg/mL 的贮备液，置于4 ℃冰箱中保存，取适量，甲醇逐级稀释，分别得到含人参皂苷 Rg150.7、101.4、202.8、405.6、608.4、811.2、1 014.0 μg/mL，人参皂苷Re 50.4、100.8、201.6、403.2、604.8、806.4、1 008.0 μg/mL，人参皂苷 Rb150.3、100.6、201.2、402.4、603.6、804.8、1 006.0 μg/mL，人参皂苷Rd 49.9、99.8、199.6、399.2、598.8、798.4、998.0 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液制备按处方和工艺，制成缺人参和三七的阴性样品，按“2.2.1” 项下方法制备，即得。

2.2.4 色谱条件和专属性试验 Thermo Accucore-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，2.6 μm）；流动相乙腈（A） -水（B），梯度洗脱（0 ～12 min，20%A； 12～15 min，20% ～26%A； 15 ～30 min，26% ～29%A； 30 ～38 min，29% A； 38 ～48 min，29% ～38% A； 48 ～55 min，38% A）；体积流量 0.8 mL/min；柱温20 ℃；检测波长203 nm；进样量5 μL，色谱图见图3。由此可知，供试品、对照品色谱峰保留时间一致，阴性无干扰，表明该方法专属性良好；理论塔板数按人参皂苷Re 计，应不低于5 000。

2.2.5 线性关系考察精密吸取“2.2.2” 项下对照品溶液适量，在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积（Y）对其质量浓度（X）进行回归，并以信噪比S/N ＝3 为检测限，S/N ＝10 为定量限，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各人参皂苷线性关系Tab.1 Linear relationships of various ginsenosides

2.2.6 精密度试验取对照品溶液适量，同一天内在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定6 次，计算日内精密度；同法连续测定3 d，每天3 次，计算日间精密度，测得人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 前者RSD 分别为0.90%、1.26%、0.98%、0.3%，后者 RSD 分别为 1.11%、1.69%、0.36%、1.04%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验精密吸取同一份供试品溶液（G4），于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.2.4”项色谱条件下进样测定，测得人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 峰面积RSD 分别为0.25%、0.54%、0.56%、1.70%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.8 重复性试验精密称取同一批本品（G4）6 份，按“ 2.2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定，测得人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 含量 RSD 分别为0.35%、1.26%、1.02%、1.53%，表明该方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验取各人参皂苷含量已知的本品（G4） 6 份，每份约2 g，精密加入100%水平的对照品溶液，按“ 2.2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd平均加样回收率分别为 102.47%、98.10%、91.21%、106.86%，RSD 分别为1.29%、1.14%、1.43%、0.68%。

2.2.10 样品含量测定取5 个厂家13 批样品适量，每批平行3 份，按“ 2.2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 各人参皂苷含量测定结果（mg/g，n＝3）Tab.2 Results for content determination of various ginsenosides （mg/g，n＝3）

3 讨论

3.1 TLC 定性鉴别皂苷类成分是人参和三七主要有效物质，其中人参皂苷Rg1、Re、Rb1为两者共有成分，人参皂苷Rf 是前者特有成分［17］，三七皂苷R1是后者特有成分［18］，故本实验选择其作为鉴别指标。再分别对3 种展开剂、2 种显色剂、4种薄层板进行考察，确定最佳色谱参数。然后，分别对供试品点样量（6 ～10 μL）、展开温度（4、25 ℃）、相对湿度（35%、58%）进行考察，发现8 μL 时展开效果最佳，低温下展开分离度更好，上述相对湿度范围内展开情况稳定。

结果，样品G1～G4 色谱在对照药材、对照品色谱相应位置上显示相同颜色斑点； G5 ～G13 中检出西洋参特有成分拟人参皂苷F11［17］，但未检出人参皂苷Rf 和三七皂苷R1，推测可能含有西洋参，而不含人参和三七。

3.2 HPLC 含量测定本实验以人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 为指标，分别对提取溶剂水饱和正丁醇用量（12.5、25、50 mL）、提取时间（15、30、60 min）、氨试液用量（20、40、60 mL）、氨试液洗涤次数（1、2、3 次）进行考察，以各成分检出量和操作简便性为原则，确定最优方案。再分别对体积流量（0.6、0.8、1.0 mL/min）、柱温（20、25、30 ℃）、色谱柱［Thermo Accucore C18（4.6 mm×150 mm，2.6 μm）、Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm × 150 mm，2.7 μm）、Waters CORTECS C18（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）］进行考察，根据分离度和分析时间确定最佳参数。

结果，13 批样品均含有人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd，但不同批次之间的差异较大；上述4 种人参皂苷含量总和，以及人参皂苷Rg1、Rb1含量比值（Rg1/Rb1）在样品G1～G4、G5～G13 之间存在明显差异。研究表明，人参、三七和西洋参中Rg1/ Rb1分别约为1.13、1.14 和0.16［19］，并且两者比值低于0.4 时为西洋参的标志［20-21］；本实验中样品G1 ～G4 的Rg1/Rb1平均值为1.048±0.085，与文献报道的人参和三七接近； G5 ～G13 其平均值为0.151±0.026，更接近西洋参。因此，为了有效控制冠心生脉丸质量，应对人参皂苷Rf、三七皂苷R1进行定性鉴别，人参和三七中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 进行含量测定。

根据上述实验结果，结合投料量、工艺、检测方法等因素，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 含量总和限度按平均值的30% 计算，建议不得低于1.0 mg/g； Rg1/Rb1稳定，其限度按3 倍标准偏差计算，建议不得低于0.79。