12例肺癌患者的肺部微生态特征分析

卓德斌，王善钻

福建莆田学院附属医院呼吸与危重症医学科，莆田 351100

许久以来，人们曾错误地认为肺脏是无菌环境，这个结论随着新一代测序技术在微生物检测中的广泛应用被推翻[1]。研究发现，在下呼吸道分泌物中均发现了低密度、多样化的微生物群落[2-3]。既往许多研究表明，健康者与呼吸道疾病患者下呼吸道的微生物是有区别的，且机体处于不同疾病状态时其微生物组成也存在差异[4-5]。肺部微生态与肺部疾病发生、发展间的关系已有诸多报道，特别是研究发现肺癌患者与健康人群微生态特征不同。但是不同病理类型、不同临床分期的肺癌患者其微生物组是否有差异，目前相关的研究则相对较少。因此，有必要探索不同病理类型、不同临床分期的肺癌患者的微生物组特征。本研究将收集肺癌患者的支气管冲洗液，探索不同病理类型，不同临床分期的肺癌患者的微生物组特征，分析肺癌患者呼吸道微生物与预后间关系是否存在相关性，从而更深入地对肺癌的生物学特征有更为深刻的认识。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集从2021 年1 月到2021 年6 月就诊莆田学院附属医院呼吸与危重症医学科经气管镜病理活检术初次确诊的肺癌患者临床资料。活检前于肺癌病灶周围行支气管冲洗，收集灌洗液；采集该批患者首次住院期间完整的电子病历资料。对其支气管冲洗液进行分析其菌群特征；详细记录患者的人口学资料、临床相关症状、临床检验资料、胸部影像学等相关临床资料。本研究获本院医学伦理委员会批准。

纳入标准：年龄在30～85 岁、无纤维支气管镜活检术禁忌证，经组织病理结果确诊为肺癌的患者；入院前1 周无抗感染治疗；完善纤维支气管镜检查前未接受介入手术、化疗、放疗或其他肿瘤相关治疗；电子病例资料完整。

排除标准：合并阻塞性肺炎；合并支气管哮喘、肺结核、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、糖尿病等可能影响微生物组的其他疾病；工作原因，曾有石棉、油漆、电焊等特殊接触史患者；患者的临床信息记录不完整。

1.2 方法 标本采集、标本管理、病原体检测方法如下：①支气管冲洗液标本采集：患者行纤维支气管镜检查过程中，在行活检术前使用2～30 ml 无菌生理盐水对病灶周围气道进行冲洗，使用一次性灭菌集痰器收集病灶周围支气管冲洗液。②支气管冲洗液标本管理：住院患者支气管冲洗液标本收集完后，对其进行编号以及患者信息标记，于1 h 内放入－20℃冰箱中保存，后转至－80℃箱中进行冻存。③病原体检测：将支气管冲洗液标本送检二代测序（NGS），通过物理破壁后，酶破壁混合震荡后提取DNA，使用MGISEO-2000 系统（MGITech CoLtd.）进行测序，通过BWA（http://bio-bwa.sourceforge.net/）与华大PMDB病原数据库进行比对，根据序列数的高低、检测深度、检测离散度及基因组覆盖度来判断可能的病原体。

1.3 观察指标 对结果进行分析整理，探索肺癌不同病理类型、不同肿瘤分期的病原微生物特征。

1.4 统计方法 采用SPSS 24.0 软件进行统计学的分析，绘图软件则采用GraphPad、Origin、STAMP等。计数资料服从正态分布时，使用t检验作两组间的比较；若资料不服从正态分布或有序等级资料时，使用非参数秩和检验方法：两样本间的检验方法采用Mann-Whitney U 检验，多样本的非参数检验用Kruskal-Wallis 检验。对计数资料则使用卡方检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 研究结果

2.1 患者一般资料 本研究纳入的12 例患者中，11 例男性，1 例女性。年龄范围为54～79 岁，平均年龄为（68.16±12.63）岁。病理分型为4 例肺鳞状细胞癌[病例序号1、3、5、6，均为男性，平均年龄（68.25±2.18）岁]，6 例肺腺癌[病例序号2、7、8、9、11、12，平均年龄（66.33±7.73）岁]，1 例肺恶性肿瘤（病例序号4）以及1 例肺部非典型癌（病例序号10）。患者的基础疾病以心脑血管疾病为主，主要诊断均为肺恶性肿瘤。见表1。

表1 12例患者的一般资料

2.2 12 例患者的支气管冲洗液标本的菌群分布 在12 例患者支气管冲洗液标本的菌群中，肺炎克雷氏伯杆菌（病例序号5、7、9，分别为鳞状细胞癌、肺腺癌、肺腺癌）、产黑色素普雷沃氏菌（病例序号8、10、11，分别为肺腺癌、非典型类癌、肺腺癌）和结核分枝杆菌（病例序号6、9、10，分别为鳞状细胞癌、肺腺癌、非典型类癌）各出现了3 次，白色念珠菌（4、12，分别为肺恶性肿瘤、肺腺癌）和缓症链球菌（病例序号1、3，均为鳞状细胞癌）出现了2 次。其余菌种均只出现1 次。见表2。

表2 12例患者的支气管冲洗液标本的菌群分布

2.3 12 例患者的治疗方案 在对12 例患者的治疗方案中，培美曲塞（病例序号2、4、7、9，分别为肺腺癌、肺恶性肿瘤、肺腺癌、肺腺癌）和卡铂（病例序号2、3、5、6、7，分别为肺腺癌、鳞状细胞癌、鳞状细胞癌、鳞状细胞癌、肺腺癌）使用最多；紫杉醇使用2 次，均在鳞状细胞癌；顺铂使用2 次，分别为肺腺癌和非典型类癌。菌群无明显改变。见表3。

表3 12例患者的菌群分布与治疗方案

3 讨论

在过去的数十年里，在理解微生物组与癌症相互作用方面取得了巨大进展。然而，大多数研究都集中在肠道微生物组上，忽略了其他微生物组如何与肿瘤相互作用。新出现的证据表明，在许多类型的癌症中，如肺癌、胰腺癌和结直肠癌，肿瘤内微生物组起着重要作用。此外，越来越多的证据表明，肿瘤内微生物对肿瘤的生物学行为具有多重影响，例如，调节肿瘤的发生和发展以及改变肿瘤对化疗和免疫治疗的反应[6]。然而，为了充分了解肿瘤内微生物组在癌症中的作用，仍然需要进一步研究其作用和机制。

最近的证据表明，肺部微生物群可以被认为是各种呼吸系统疾病的生态决定因素之一。有学者比较了常见呼吸系统疾病的肺部微生物群和肺部免疫特征，使用MiSeq 测序系统分析呼吸疾病（肺癌、原发性肺结核、社区获得性肺炎）患者的支气管肺泡灌洗液，发现肺癌患者的细菌多样性和丰富度均高于原发性肺结核和社区获得性肺炎患者[7]。线性判别分析效应量显示，原发性肺结核组和肺癌组社区获得性肺炎相关肺微生物群差异显著。在原发性肺结核组和肺癌组中发现的关键功能细菌差异属多于社区获得性肺炎组。交互作用网络显示肺癌组与这些细菌属之间的正负相关性强于其他两组[8]。然而，在原发性肺结核组中观察到支气管肺泡灌洗液细胞因子谱高于其他两组，而支气管肺泡灌洗液细胞因子与关键功能细菌相关[9]。这项研究为肺微生物群改变、支气管肺泡灌洗液炎症和不同呼吸系统疾病之间的关联提供了证据，从而促使研究者们开始深入了解肺微生物群在呼吸系统疾病进展中的可能作用和机制。肺癌患者、肺部病变患者、健康人的支气管中都存在拟杆菌门、放线菌门、变形杆菌门、厚壁菌门等微生物；其中肺癌患者的普氏杆菌属是优势菌群，与肺部病变患者、健康人有明显差异[10]。另有研究发现，肺癌患者的微生物构成以拟杆菌门和变形菌门为主，如无色菌属、不动杆菌属、放线菌属等，同时库克菌属、链球菌属和葡萄球菌属等机会性致病菌也在肺癌患者中广泛存在[11-12]。此外，肺部菌群变化和免疫相关，在免疫治疗前、治疗中或治疗后不久使用抗生素治疗降低了免疫治疗对肺癌的疗效[13]。可见，进一步阐明肺微生物与宿主免疫状态之间的关系，可以发现新的治疗靶点，有助于发掘新的治疗方法。

本研究发现，本研究的12 例患者中，病理分型为4 例肺鳞状细胞癌、6 例肺腺癌、1 例肺恶性肿瘤以及1 例肺部非典型癌；平均年龄为（68.16±12.63）岁；患者的基础疾病以心脑血管疾病为主，主要诊断均为肺恶性肿瘤。在12 例患者支气管冲洗液标本的菌群中，共发现了缓症链球菌、链球菌、米勒链球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、麻疹孪生球菌、巨细胞病毒、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、白色念珠菌、肺炎克雷伯杆菌、结核分枝杆菌等18 种菌种；革兰氏阳性菌、阴性菌各6 种。在这些菌种中，肺炎克雷氏伯杆菌、产黑色素普雷沃氏菌和结核分枝杆菌各出现在3 例患者的支气管冲洗液中，白色念珠菌和缓症链球菌出现在了2 例，其余菌种均只出现1 次。在12 例肺癌患者中，存在链球菌、草绿色链球菌、结核分枝杆菌、假丝酵母菌。12 例患者的治疗方案中，培美曲塞（应用在肺腺癌、肺恶性肿瘤、肺腺癌、肺腺癌）和卡铂（应用在肺腺癌、鳞状细胞癌、鳞状细胞癌、鳞状细胞癌、肺腺癌）使用最多；紫杉醇使用2 次，均在鳞状细胞癌；顺铂使用2 次，分别为肺腺癌和非典型类癌。患者在治疗前后菌群无明显变化。

肺癌患者呼吸道微生物中的物种多样性及结构多样性可能存在明显差异，但各研究结论不全一致。本研究发现，肺癌患者的支气管菌群中以链球菌、草绿色链球菌、结核分枝杆菌、假丝酵母菌为主；肺癌患者的治疗以培美曲塞、卡铂、紫杉醇、顺铂为主。