豆类蛋白聚集机制及调控措施研究进展

李美麒　张学敏　王金辰　刁静静　王长远　徐旖欣　曹荣安

摘要：目前在食品加工、化学工业生产以及生物医药等领域普遍存在蛋白质聚集的现象。近年来，豆类蛋白生产规模不断扩大，其营养价值及经济效价优势显著。基于此，越来越多的学者对豆类蛋白聚集、解聚行为进行了深入探讨。但豆类蛋白在食品加工过程中会产生一些聚集行为，这是不可避免的现象。随着加工食品的手段越来越多样化，豆类蛋白的聚集行为对食品品质、口感、风味的影响也逐渐引起人们的重视。文章介绍了豆类蛋白聚集行为的产生机理，系统详尽地综述了调控豆类蛋白聚集行为的措施及对豆类蛋白聚集行为进行表征的方法。相信豆类蛋白在未来可以成为更好的蛋白质补充方式，有更加广泛的发展和应用空间，并希望为研究豆类蛋白聚集行为提供更多的理论支持。

关键词：豆类蛋白；聚集行为；调控措施；研究进展

中图分类号：TS201.21文献标志码：A 文章编号：1000-9973（2024）01-0209-05

Research Progress on Aggregation Mechanism and Regulatory Measures of Legume Proteins

LI Mei-qiZHANG Xue-minWANG Jin-chenDIAO Jing-jingWANG Chang-yuanXU Yi-xinCAO Rong-an1*

Abstract： At present， the phenomenon of protein aggregation is widely found in the fields of food processing， chemical industrial production and biomedicine. In recent years， the production scale of legume proteins has been continuously expanding， and its nutritional value and economic value advantages are significant. Based on this， more and more scholars have conducted in-depth discussion on aggregation and deaggregation behavior of legume proteins. However， it is inevitable that legume proteins exhibit some aggregation behavior during food processing. With the increasing diversification of food processing methods， the aggregation behavior of legume proteins has gradually attracted people's attention to its effect on food quality， taste and flavor. In this paper， the generation mechanism of aggregation behavior of legume proteins is introduced， and the measures to regulate the aggregation behavior of legume proteins and the methods to characterize the aggregation behavior of legume proteins are systematically reviewed. It is believed that legume proteins can become a better protein supplemental method in the future， with a broader development and application space， so as to provide more theoretical support for the study on aggregation behavior of legume proteins.

Key words： legume proteins; aggregation behavior; regulation measures; research progress

豆类蛋白的聚集行为主要是食品加工过程中蛋白质因受到外界作用而产生的一种蛋白质变性现象。由于豆类蛋白具有良好的功能特性，因豆类蛋白的变性或聚集引起的蛋白质结构和化学组成的變化都可能影响其在食品加工中的应用，还会导致食品生产过程中的口感变化以及对贮藏条件要求的变化。因此，深入了解豆类蛋白的聚集行为机理有利于深入了解其稳定性，在加工过程中更好地利用豆类蛋白有利的聚集行为，或通过介入某些手段对产生的聚集行为进行调控，从而改变不利的聚集行为，这些对豆类蛋白在食品加工过程中的应用起着重要作用。例如，了解豆类蛋白的结构和稳定性有助于最大限度地减少由热引起的化学变化，有助于保持豆类蛋白的营养价值、结构和功能特性，通过控制豆类蛋白聚集行为可以得到不同类型的蛋白聚集体，用于营养成分和风味物质的改善[1]，亦或是了解调控豆类蛋白聚集行为的一些方法，从而改变已经发生的豆类蛋白聚集行为。

1 豆类蛋白聚集行为产生机理

豆类蛋白与其他蛋白质一样，本质上都是通过肽链连接形成的，还有一些分子间或分子内的次级键连接形成的具有四级结构的多肽，如二硫键、氢键、离子键、疏水相互作用和范德华力等[2]。而豆类蛋白的聚集则是蛋白质分子在某些特定的条件下发生改变，如部分展开或折叠，并以特定的方式结合形成蛋白质的高级结构[3]。产生了聚集行为的豆类蛋白构象不会像天然蛋白质那样，变性后的蛋白是疏水性氨基酸暴露在蛋白质表面，使暴露的疏水残基增加了与其他分子相互作用的概率，通过疏水相互作用生成了豆类蛋白的聚集体。

Andrews等[4]指出，非天然蛋白质聚集是指原始单体或未聚集的蛋白质或多肽自发自组装形成的，具有高水平的非天然二级结构的中、高分子量聚集体的过程，这些非天然结构通常（但不总是）富含蛋白质内和蛋白质间的β-折叠。目前学者们较认同的蛋白质聚集的机理是 A Lumry-Eyring Nucleated Polymerization Model的动力学模型，该模型包含5个阶段：第一阶段是未聚集的蛋白质的构象转换，包括在构象状态之间的所有转变，被足够高的自由能垒隔开，二、三、四级结构被破坏，导致蛋白质分子内部疏水基团暴露；第二阶段是预成核阶段，该阶段描述了肽链的可逆结合，暴露出来的疏水基团相连接，导致变性蛋白质相互作用形成新的可逆的寡聚体；第三阶段是最小的不可逆聚集体的成核阶段，也属于启动或成核的阶段，寡聚体重新排列组合形成了聚集体的核心；第四阶段是通过聚合成可溶性聚集体，可溶性聚集体会发生重排或二级结构产生变化以形成不断增长的聚集体；第五阶段是冷凝或聚集体-聚集体组装过程，为了形成分子量更高的聚集体。

2 聚集体分类

聚集体通常指代二聚体、四聚体和其他可以通过分子排阻色谱分离的物质，蛋白质聚集描述了蛋白质缔合反应，蛋白质聚集体的大小范围可以从纳米到微米级。可逆的（可解离的）蛋白质聚集通常是由相对较弱的非共价键相互作用引起的蛋白质聚集，可以形成在溶液中的天然分子之间，聚集体的解离可以简单地通过稀释溶液来实现，通常是由溶液条件（pH、温度等）变化引起的；不可逆的（按条件解离的）聚集是发生在较高分子量的物质中，不是简单地逆转产生聚集的条件，而是需要添加变性剂或还原剂才能使聚集体解离，或通过加热、添加缓冲液或增加其他条件来恢复单体物质，因此蛋白质聚集体的分类[5]可按其大小、可逆性、构象变化、化学键修饰和形态结构变化进行总结，见表1。

3 豆类蛋白聚集行为的表征手段

3.1 浊度法

浊度法是通过测量豆类蛋白质溶液在某一波长下的吸光度值，从而确定蛋白质在不同处理条件下的聚集程度，此操作中蛋白质溶液的紫外吸光度值即可视为浊度，浊度值越高，蛋白聚集程度越明显。为表征蛋白质溶液的浊度变化，一般检测小粒径聚集体时，使用400 nm处的紫外吸光度值，而检测大聚集体时，使用600 nm 处的紫外吸光度值[6]。李杨等[7]通过对浊度值的测量，得出了绿豆蛋白在超声作用下能够有效破碎溶液中的大聚集体，减小蛋白质的粒径，进而降低绿豆蛋白溶液的浊度。

3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳法

SDS-PAGE又称为聚丙烯酰胺凝胶电泳，是一种以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的区带电泳，利用SDS作为阴离子去污剂，与蛋白质亚基结合形成蛋白质-SDS棒状复合物，消除了不同种类蛋白质分子之间的原有电荷差异。白俊堃等[8]使用聚丙烯酰胺凝胶电泳证明了超声处理红小豆分离蛋白导致其疏水性增强，表明超声造成的蛋白质聚集不是由共价键连接的而是由非共价键连接的，如静电作用和疏水作用是促进蛋白聚集的主要作用力，其缺点是改变了蛋白质的分子结构，破坏了蛋白质分子之间及其他物质分子之间的非共价键，因此不能作为豆类蛋白聚集形态的分析检测。

3.3 表面疏水性

豆类蛋白中有许多非极性氨基酸暴露在蛋白质分子的表面，这些氨基酸侧链因排斥水而聚集在一起，这就是蛋白质的疏水性。所以，可以通过检测蛋白质的疏水性这一指标，从而判断在不同条件下的蛋白质聚集程度。疏水相互作用在蛋白质的稳定性、构象和功能特性中起着重要作用[9]，作为与周围环境接触的蛋白质分子表面疏水基团含量的指标，蛋白质表面疏水性比总疏水性对功能的影响更大[10]。Creusot等[11]得出，大豆球蛋白在经过酶解后，内部非极性残基暴露出来，使其蛋白质表面疏水性增大，從而导致了聚集。

3.4 傅里叶变换红外光谱

傅里叶变换红外光谱（FTIR）可用于研究各种条件影响下的蛋白构象，并通过FTIR光谱定量评估其蛋白的结构变化[12]。傅里叶变换红外光谱常被用于研究各种食物蛋白质的构象，例如燕麦球蛋白、乳清蛋白、大豆球蛋白和小麦面筋等。孙佳悦等[13]利用傅里叶变换红外光谱技术分析表明，热处理会破坏蛋白结构，变性过程中分子中的氢键会被破坏，引起聚集，产生变性蛋白聚合物。刘燕燕等[14]利用FTIR分析表明，短时间脉冲能够引起β-折叠结构略微减少，且随着脉冲时间的延长，峰会发生迁移，证明了大豆分离蛋白聚集行为增加。

3.5 荧光光谱

由于蛋白质中存在酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质本身就能吸收紫外光而产生荧光，因此可用于蛋白质的定量研究。蛋白质的荧光光谱主要与自身芳香族氨基酸残基的极性有关，当蛋白质结构展开后，色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸的生色基团会暴露在溶剂中，发生淬灭，荧光强度会降低，因而蛋白质的荧光光谱可以用来推测蛋白质分子三级结构的变化[15]。豆类蛋白的疏水区域可以使用荧光强度来表示，荧光强度与蛋白质浓度成正比[16]。荧光光谱可以反映聚集的增长过程，张业辉[17]通过荧光光谱检测蛋白二级构象，发现随着加热时间的延长，荧光强度逐渐变强，α-螺旋转化成β结构，证明了加热会导致芸豆蛋白产生聚集行为。Wu等[18]通过荧光光谱检测出大豆蛋白的聚集是通过疏水相互作用和暴露的疏水残基来修饰的。

3.6 原子力显微镜和扫描电子显微镜

原子力显微镜用于直接观测豆类蛋白聚集体，并可直接明确豆类蛋白的聚集形态和大小。张业辉通过原子力显微镜对芸豆蛋白进行了表征，证明了蛋白浓度和加热时间促进了蛋白质纤维化聚集的增长，并推测这种蛋白质的纤维化聚集可能是螺旋状结构的[17]。

扫描电子显微镜图像是在150倍放大率下获得的，可以帮助观察到不同处理条件下的豆类蛋白微结构。Jiang等[19]应用扫描电子显微镜得出：经过不同程度超声处理和冷冻干燥的样品会表现出更多的无序结构和不规则碎片，此时官能团（如疏水基团）暴露出来，它们立即相互作用，导致蛋白质聚集的形成。Tang等[20]发现分散体中的聚集体越小，它们的溶解度就越高。

3.7 圆二色谱法

圆二色谱法可以用于检测豆类蛋白发生聚集前后二级结构的变化及对调控手段的检测，如局部氨基酸序列片段之间的相互作用，以及处理后的分子不同部分之间的相互作用的破坏，可能导致蛋白质分子的聚集，此时二级结构中的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的比例会发生变化。Jiang等[19]通过圆二色谱法发现超声处理诱导的蛋白质聚集体表现出高 β含量，并且具有大量天然α-螺旋结构的蛋白质在超声处理后显示出β结构的增加，同时聚集体中的α-螺旋结构减少。毕爽等[21]通过圆二色谱法超声处理黑豆分离蛋白（36 min，300 W）导致α-螺旋上升，β-折叠下降，认为其余超声处理条件均会导致α-螺旋下降。

3.8 分子排阻色谱法

分子排阻色谱法是以具有一定孔径范围的多孔凝胶为固定相，流动相为液体的色谱法，又称凝胶色谱法或空间排阻色谱法。样品组分会按照分子大小受到不同的排阻而先后由色谱柱排出，因此可通过停留在色谱柱的时间不同来对其分子量进行分布分析。郭健[22]通过分子排阻色谱法得知，变性蛋白质的溶解性可以通过水热处理提高，从而产生了可溶性聚集体，并且在pH 7.0，8.0，9.0时碱性多肽的谱图表明，经过水热处理后可溶性组分（上清液）有大量聚集体形成。

4 豆类蛋白聚集调控措施

安然[23]将大豆蛋白进行热处理后，研究表明，蛋白质的二级结构组分含量发生了变化，其中β-折叠结构含量降低，无规则卷曲结构含量增加，即大豆分离蛋白的二级结构从有序向无序结构转变。王冬梅等[24]研究表明，随着热处理温度的升高，大豆蛋白形成了可溶性聚集体，粒径和分子量逐渐增大，浊度显著增加。60，80 ℃热诱导的聚集体以单个分子颗粒状形式存在，而100 ℃热诱导的聚集体呈小尺寸粒子形式。

豆类蛋白的聚集对于蛋白质资源的有效利用和食品品质的提高具有重要意义，增加豆类蛋白的聚集在食品生产过程中有重要意义，如豆腐是利用大豆蛋白的凝胶能力制成的大豆制品，腐竹也是利用豆类蛋白聚集行为的食品，对豆类蛋白聚集行为的有效利用可以得到一些品质优良、营养价值高的食品。而一些物理方法如超声、均质化、高压和脉冲电场等可作为调控蛋白聚集的手段用以修饰蛋白质的结构和改善蛋白质的功能性质，这些非热技术被认为是热处理的替代品或辅助手段，可以在低温下改善营养物质的保存和食物的感官质量[25]。近年来，使用超声作为调控豆类蛋白聚集的手段较多，因为超声调控不仅操作简便，而且更适合在食品工厂中应用。

4.1 热处理对豆类蛋白聚集的影响

热处理诱导蛋白质聚集是最常见的一种调控蛋白聚集的方式，因为在加工豆类蛋白时，无论是杀菌处理还是喷雾干燥等工艺操作都避免不了热加工处理。而热诱导蛋白质聚集的原理是当温度达到某一值时，蛋白质内部热处理诱导的蛋白聚集是蛋白质非天然聚集，并且是一种不可逆过程[26]。加热杀菌以及喷雾干燥对豆类蛋白及其制品的功能性质，如溶解性、乳化性、乳化稳定性等具有较大影响。目前对豆类蛋白的热处理改性有广泛的研究[27]。

4.2 微波对豆类蛋白聚集的影响

微波是电磁频谱的一部分，频率范围为300 MHz～300 GHz，对应于1 m～1 mm的波长范围，微波处理的热效应与水、有机分子或离子吸收微波能量后产生的热量有关[28]。然而，微波增强效应是指可观察到的现象，不能仅用微波处理物质的温度升高来解释，大量科学证据将微波增强效应归因于微波处理的非热效应的存在。微波加热是通过直接吸收能量并将其转化为热量来实现的[27]，人们普遍认为，微波场引起的蛋白质结构构象是由于微波的热效应造成的[29]。然而，Gomaa等[30]提出，微波的非热效应也可能对蛋白的二級和三级结构产生影响。

4.3 冷冻对豆类蛋白聚集的影响

冷冻下的蛋白分子多肽链会由规则变化变为不规则聚集，可能发生的是不可逆的冻结变性。赵娅柔[31]在对大豆蛋白进行冷冻诱导处理的过程中，发现在较高温度如-5 ℃下比在低温条件下更容易发生游离变性，形成不易溶的聚集体，即大豆蛋白发生了不完全变性。随着冷冻温度降低，蛋白的聚集行为增强，形成了不可溶聚集体。荣荟等[32]研究表明，随着冷冻诱导程度的加深，蛋白的溶解性降低，浊度升高，蛋白质发生聚集，导致其微观结构由稀疏到致密，变得更加稳定。

4.4 脂质氧化作用对豆类蛋白聚集的影响

脂质过氧化反应产生的自由基可诱导蛋白质聚集，脂质过氧化反应诱导的蛋白质聚集是自由基链式反应聚合引起蛋白质-蛋白质的交联[33]。丙烯醛作为脂质过氧化的代表性次级副产物，Wu等[18]研究表明，随着丙烯醛浓度的增加，聚集体会逐渐形成。

4.5 脉冲电场对豆类蛋白聚集的影响

脉冲电场（PEF）是一种非热食品保存方法[34]，可替代巴氏杀菌。使用恒定的PEF处理288 μs，大豆分离蛋白的溶解度随着PEF强度的增加而增加，当PEF处理强度为30 kV/cm时，其溶解度达到最大值（82%）。当PEF处理强度达到30 kV/cm 以上时，SPI的溶解度略有下降，即增加了聚集。Li等[35-36]研究PEF对大豆分离蛋白理化性质的影响发现，经一定强度的脉冲电场处理后的大豆分离蛋白会由于疏水相互作用和二硫键使其发生变性和聚集。

4.6 高压均质对豆类蛋白聚集的影响

将蛋白质溶液分别以103 MPa和207 MPa通过高压均质机处理，Yang等[37]在对蚕豆蛋白进行研究时，证明高压均质可以调节蛋白质聚集体之间的疏水相互作用，导致大蛋白质聚集体（>1 μm）解离成可溶性分子聚集体。

4.7 超声调控对豆类蛋白聚集的影响

低功率的超声处理会破坏豆类蛋白分子内部疏水相互作用，加速蛋白质分子运动，导致蛋白质聚集。而在中功率的超声处理中会引发不稳定的聚集体被空化力分解成较小的可溶性蛋白聚集体，在高功率的超声处理中，聚集体会通过非共价相互作用再进行聚合。

超声处理对于豆类蛋白聚集行为的调控主要是由空化效应引起的物理化学综合作用的结果[38]，由于超声波具有绿色、高效、操作简单等优点，适合在食品工厂中进行食品加工[39]。超声处理可以改变聚集体的三级结构，减小粒径，提高溶解度和表面疏水性[40]。高强度超声可产生强烈的空化效应和机械力，可用于改变豆类蛋白的理化和功能性质[41]。

5 总结与展望

目前国内外对于豆类蛋白的研究已经较为深入，研究豆类蛋白质的聚集行为在食品加工过程中的结构和功能特性具有重要意义。现有研究表明豆类蛋白的聚集行为会破坏蛋白质的结构，从而影响其溶解性、乳化性及其他功能特性。由于豆类蛋白的聚集行为对结构和功能的影响是复杂的，甚至有些调控手段会互相影响，因此不同的调控技术对豆类蛋白聚集的影响机制仍需要进一步研究。而本文除了对豆类蛋白的聚集行为进行概述以外，更希望植物蛋白资源可以被更多人研究、开发和利用，豆类蛋白资源的应用前景也会随着研究的深入变得更加广阔。未来，对豆类蛋白聚集可以在药食同源方面进行研究，利用豆类蛋白的聚集行为调节人体内常见的高血脂、高血糖甚至心脑血管类疾病。

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收稿日期：2023-07-16

基金項目：中央引导地方科技发展专项（DQKJJYD0001）

作者简介：李美麒（1997—），女，硕士研究生，研究方向：食品科学。

*通信作者：曹荣安（1980—），男，副教授，博士，研究方向：食品科学。