桂花色素的超声辅助提取工艺及其抑菌效应分析

谭志梅　王晨戍　王淑培　杭方学　张静　黄晓菲

摘要：桂花色素是一种性能优良的天然色素，在食品加工工业中具有广阔的应用前景。试验以浦城桂花为原料，通过单因素试验考察了桂花品种、乙醇浓度、超声功率、超声时间、液料比对桂花色素得率的影响，进一步进行响应面试验优化其提取工艺。同时通过牛津杯法验证提取的桂花色素对7种菌株（4株细菌，2株丝状真菌，1株酵母菌）的抑菌效应。试验结果表明，超声辅助法提取桂花色素的最佳提取条件为乙醇浓度60%、液料比25∶1 （mL/g）、超声功率200 W、超声时间30 min，在此条件下，桂花色素的得率最高，达到61.56%。此外，抑菌试验证实桂花色素对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、藤黄微球菌、酿酒酵母具有显著的抑制作用，而对桔青霉和米曲霉的抑制效应相对较弱。

关键词：桂花；色素；超声波；响应面分析法；抑菌效应

中图分类号：TS264.4文献标志码：A 文章编号：1000-9973（2024）01-0177-06

Analysis of Ultrasonic-Assisted Extraction Process and Antibacterial Effect of Osmanthus fragrans Pigment

TAN Zhi-meiWANG Chen-shuWANG Shu-pei2*， HANG Fang-xue   ZHANG Jing3， HUANG Xiao-fei3

Abstract： Osmanthus fragrans pigment is a kind of natural pigment with excellent performance， which has broad application prospect in the food processing industry. In this test， with Pucheng Osmanthus fragrans as the raw material， the effects of Osmanthus fragrans varieties， ethanol concentration， ultrasonic power， ultrasonic time and liquid-solid ratio on the yield of Osmanthus fragrans pigment are investigated by single factor test， and the extraction process is further optimized by response surface test. At the same time， Oxford cup method is used to verify the antibacterial effects of Osmanthus fragrans pigment on seven strains （including four strains of bacteria， two strains of filamentous fungi and one strain of yeast）. The results show that the optimal extraction conditions of Osmanthus fragrans pigment by ultrasonic-assisted extraction method are ethanol concentration of 60%， liquid-solid ratio of 25∶1 （mL/g）， ultrasonic power of 200 W and ultrasonic time of 30 min. Under these conditions， the yield of Osmanthus fragrans pigment is the highest， reaching 61.56%. In addition， in the antibacterial test， it is confirmed that the Osmanthus fragrans pigment has significant inhibitory effects on Bacillus subtilis， Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Micrococcus luteus and Saccharomyces cerevisiae， while the inhibitory effects on Penicillium citrinum and Aspergillus oryzae are relatively weaker.

Key words： Osmanthus fragrans； pigment； ultrasonic wave; response surface analysis methodology； antibacterial effect

桂花（Osmanthus fragrans （Thunb.） Lour.），又名木犀、岩桂、九里香等，属木犀科植物，原产于我国西南部，主要分布于中亚热带和北亚热带地区[1-2]。桂花品类繁多，且富含碳水化合物、蛋白质、维生素、花青素等，在世界上被称为“全营养食品”[3-4]。桂花除用以鉴赏外，在化妆品、食品调香、药品、天然色素提取等领域也有极广阔的应用前景[5-8]。随着人们生活水平的不断提高，天然植物色素受到广泛的关注，天然色素不仅安全性高，而且具有一定营养和保健作用。因此，开发和使用天然色素逐渐成为发展趋势[9]。桂花色素因色调鲜明亮丽、性能稳定等优点被视为品质优良的色素提取来源，除了可用于食品着色外，还具有一定的药用价值，刘东阳等[10]研究表明，桂果中提取的色素性能稳定，具有一定的抗氧化活性，可作为天然色素资源应用于食品领域；黄玲艳[11]以金桂花为原料，研究发现桂花提取物具有较好的抗氧化活性和抗衰老作用；马森等[12]用石油醚从桂花中提取色素，结果表明桂花色素可显著清除亚硝酸盐；李志洲等[13]对桂花色素的稳定性进行研究，发现提取出的桂花色素在酸性条件下较稳定，常见的食品添加剂及抗氧化剂对其稳定性的影响不大。溶剂提取法、浸渍压榨提取法、酶反应提取法、微生物发酵法等都是傳统的天然色素提取方法，为了更好地提取及利用色素，微波辅助提取、超声辅助提取、分子蒸馏萃取等方法也被广泛研究应用[14-16]。浦城县位于福建省最北部，栽培桂花历史悠久，品种多样，全县现有桂花林面积1 333 hm2以上，年产鲜桂花3×105 kg，综合利用潜力巨大[17-18]。本试验以浦城县5种主要桂花品种浦城丹桂、四季桂、状元红、金桂、银桂为原料，采用超声辅助法从中提取天然食用色素，旨在选取色素提取率最高的桂花品种，并进一步优化工艺，提高色素产量；同时研究桂花色素提取物对代表性细菌和真菌的抑制效应，以期为桂花天然食用色素的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，ATCC6633）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）、大肠埃希菌（Escherichia coli，ATCC25922）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus，ATCC49732）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，ATCC9763）、桔青霉（Penicillium citrinum，ATCC9849）、米曲霉（Aspergillus oryzae，ATCC42149）、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：广东环凯微生物科技有限公司；蛋白胨、牛肉浸膏、琼脂粉、氯化钠（AR）：上海展云化工有限公司；无水乙醇（AR）：三明市三圆化学试剂有限公司；浦城丹桂、四季桂、状元红、金桂、银桂干花：浦城县木樨园营养食品有限公司。

1.2 仪器与设备

DHZ-9070A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Neofuge 23R台式高速冷冻离心机 上海力申科学仪器有限公司；UV-3200PC紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；RE52-99旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；2XZ-2旋片式真空泵 台州市椒江宏兴真空设备厂；YXQ-LS-50S立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ZD-85恒温振荡器 常州国华电器有限公司；LRH-150F生化培養箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 桂花色素提取液的制备

准确称取1.000 g桂花粉置于烧杯内，按试验设计的液料比（mL/g）加入乙醇溶液（体积比），移入超声波细胞粉碎机中，在一定的超声功率、超声时间下进行桂花色素提取。对提取后的浸提液进行抽滤（－0.1 MPa），将抽滤后的提取液移入台式高速冷冻离心机中进行离心（4 ℃，4 500 r/min，15 min），弃去沉淀后即得到桂花色素提取液。

1.3.2 桂花色素粗提物的制备

将上述提取液置于旋转蒸发仪中进行浓缩（55 ℃，－0.1 MPa），浓缩至黏稠状。将黏稠状的浓缩液置于真空干燥箱中干燥（60 ℃）至恒重，即获得桂花色素粗提物[19]。

1.4 试验方法

1.4.1 标准曲线的绘制

参考刘娅涵等[20]的方法，称取0.110 g桂花色素粗提物，加入少量60%乙醇溶解，转移至100 mL容量瓶中，以60%乙醇定容至刻度线，摇匀，得到1 000 μg/mL的桂花色素母液。用移液管分别移取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL的桂花色素溶液于100 mL容量瓶中，分别用60%乙醇定容至刻度线，摇匀，得到浓度分别为5，10，15，20，25，30，35，40 μg/mL的桂花色素工作液。以60%乙醇溶液调零，在保护层波长330 nm下测定其OD值，并绘制标准曲线，其标准曲线方程为y=0.116x－0.001（R2=0.999 8）。

1.4.2 得率的计算

经超声辅助法提取得到的桂花色素溶液，经真空抽滤后离心，弃去沉淀定容至50 mL，稀释适宜倍数得到样品测试液，以相应浓度的乙醇溶液调零，在波长为330 nm条件下测定其OD值。根据绘制的桂花色素标准曲线所得的线性回归方程计算出桂花色素样品液浓度。

色素得率（%）=（C×d×50）/（m×106）×100。

式中：C为样品测试液桂花色素溶液浓度，μg/mL；d为稀释倍数；50为桂花色素提取液定容体积，mL；m为桂花质量，g；106为单位换算系数，1 g=106 μg。

1.4.3 单因素试验

以OD330 nm值表征色素含量，分别考察了桂花品种、乙醇浓度、超声功率、超声时间、液料比对桂花色素得率的影响。各品种桂花分别筛选、去除杂质，低温烘干，用超微粉碎机粉碎，过60目筛。准确称取一定量桂花样品，参考赵娟娟等[21]的方法，在液料比20∶1 （mL/g）、乙醇浓度70%、超声功率200 W、提取温度55 ℃、提取时间30 min的条件下提取桂花色素，研究不同桂花品种（浦城丹桂、四季桂、状元红、金桂、银桂）对桂花色素提取率的影响。以四季桂为原料，研究不同乙醇溶液浓度（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、超声功率（80，120，160，200，240，280，320 W）、提取时间（10，20，30，40，50，60，70 min）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL/g）对桂花色素吸光度值的影响，取1 mL溶液稀释至25 mL，测定其OD值，试验重复3次。

1.4.4 响应面优化试验

基于上述单因素试验的结果，选定四季桂为提取原料，选取乙醇浓度、超声功率、超声时间、液料比为考察因素，按照Box-Behnken试验设计原理，进行四因素三水平响应面试验[22]，试验因素和水平见表1。

1.4.5 抑菌试验

将枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、藤黄微球菌分别接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面上，于37 ℃培养24～48 h，备用；将酿酒酵母、桔青霉、米曲霉接种到PDA培养基斜面上，于27 ℃培养2～5 d，备用。取活化好的菌种斜面，用灭菌生理盐水制成107～108 CFU/mL的菌悬液，备用[23]。

将桂花色素粗提物用DMSO精确配成0（对照组），2.5，5，10，15，20，25 mg/mL系列浓度的溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤后备用。参考陈光等[24]的方法，采用牛津杯法测试桂花色素对7种指示菌的抑菌作用。每个处理4个重复。

1.4.6 数据处理与分析

运用Excel 2019统计所有数据，数据分析采用SPSS 20软件。方差分析采用ANOVA，采用Duncan's多重比较进行差异显著性分析。图表绘制采用Origin 9.0软件。正交试验设计及分析使用Design-Expert 8.0.6.1软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果及分析

2.1.1 桂花品种对得率的影响

试验选择了浦城丹桂、四季桂、状元红、金桂、银桂5个品种的桂花进行色素的提取，桂花品种对桂花色素得率的影响见图1。

由图1可知，在相同的提取工艺条件下，四季桂的色素得率最高（49.52%），银桂、金桂、状元红次之，浦城丹桂的色素得率较低。故后续色素提取原料选定四季桂。

2.1.2 乙醇浓度对得率的影响

乙醇浓度对桂花色素得率的影响见图2。

由图2可知，乙醇浓度在30%～60%范围内，色素得率不断上升，且在乙醇浓度为60%时取得极值51.38%。其原因可能是随着乙醇浓度的增加，色素分子与乙醇充分接触，色素溶出率增加，提取初期桂花色素-乙醇溶液中色素浓度差异大，利于提取。乙醇浓度继续增大，得率下降，当乙醇浓度大于80%时，得率陡然下降，可能是随着乙醇浓度的增加，提取剂的极性增大，使醇溶性、脂溶性的物质析出，而这些物质与色素形成竞争，并与乙醇-水分子结合而导致的[25]。乙醇浓度达到80%后，色素分子结构被分解破坏，导致得率下降，故乙醇浓度选取60%为宜。

2.1.3 超声功率对得率的影响

超声功率对桂花色素得率的影響见图3。

由图3可知，超声功率在80～200 W范围内，随着超声功率的增大，桂花色素得率上升，在超声功率为200 W时，得率达到最大值51.36%。其原因可能是色素提取需要适宜的超声功率，超声功率较低时，植物细胞壁破坏不充分，提取速率较慢，随着功率的增大，色素分子在乙醇中的溶解度提升，使得率提升。而当超声功率增加到200 W以后，超声产生的空化效应增强，提取体系中超声波的物理振荡作用进一步加强，致使色素的分子结构被破坏[26]，同时随着超声功率的增大，提取体系温度上升也不可避免地造成了提取剂的挥发，最终导致得率下降，故超声功率选取200 W为宜。

2.1.4 超声时间对得率的影响

超声时间对桂花色素得率的影响见图4。

由图4可知，随着超声时间的延长，桂花色素得率整体呈先上升后下降的趋势。在超声时间为30 min时达到极值57.87%。超声时间为10～20 min时，得率上升缓慢，这是因为桂花色素与乙醇溶剂需要一定时间的充分接触才能被提取出来，超声时间过短，超声提取的作用没有充分发挥，得率较低。当超声时间达到30 min时，更多溶剂渗入细胞内部，促进色素的溶出，使得桂花色素取得最大得率[27]。超声时间继续增加，得率明显下降，可能是因为提取体系长时间超声处理以及一直处于较高温度加速了色素的分解，使得色素得率下降，故超声时间选择30 min为宜。

2.1.5 液料比对得率的影响

由图5可知，液料比由10∶1（mL/g）上升到25∶1（mL/g）的过程中，桂花色素的得率也随之上升，在液料比为25∶1（mL/g）时取得最大值61.53%，可能是因为随着溶剂的增加，渗透压增加，利于提取。随着液料比继续增加，得率显著下降，其原因可能是液料比增加后，有机溶剂添加过多使得其他杂质溶出，影响了色素本身的溶出，因此液料比过高并不利于色素浸提[28]，故液料比选择25∶1（mL/g）为宜。

2.2 响应面试验结果

响应面试验设计与结果见表2。采用Design-Expert 8.0.6.1软件对色素得率的结果进行回归分析，以桂花色素得率为响应值，乙醇浓度（A）、超声功率（B）、超声时间（C）、液料比（D）为自变量，得到二次多项回归模型：Y桂花色素得率 =61.47－1.04A+1.37B－0.43C+0.67D+0.11AB+0.59AC－1.51AD+0.08BC－1.21BD+0.30CD－3.61A2－5.60B2－4.93C2－5.06D2。

由表3可知，回归模型的P＜0.000 1，模型极显著，失拟项不显著，表明该方程拟合性较好， RAdj2=0.986 5，说明数据可靠性较高。试验中A（乙醇浓度）、B（超声功率）、C（超声时间）、D（液料比）对色素得率的影响极显著；交互项中，AD、BD极显著，AC显著。由F值可知，各试验因素影响顺序为超声功率（B）＞乙醇浓度（A）＞液料比（D）＞超声时间（C）。

2.3 验证试验

通过Design-Expert 8.0.6.1软件对回归方程进行解析，得到最优的桂花色素提取工艺参数为乙醇浓度58.39%、超声功率204.47 W、超声时间29.49 min、液料比25.37∶1 （mL/g），在此条件下桂花色素预测得率为61.66%。结合实际操作的可行性，将最优工艺参数修正为乙醇浓度60%、超声功率200 W、超声时间30 min、液料比25∶1 （mL/g）。在修正工艺条件下进行3次验证试验，桂花色素得率平均值为61.56%，与预测值的相对误差为0.16%，说明利用响应面法优化后得到的色素提取参数具有实际指导意义，且所得工艺参数可信，预测的回归模型对优化超声波细胞破碎辅助法提取桂花色素的工艺是可行的。

2.4 桂花色素抑菌效果的研究

桂花色素粗提液对不同指示菌的抑菌效果见表4。

由表4可知，相对于对照组（DMSO），当桂花色素粗提液的浓度大于5 mg/mL时，对所选的7种指示菌均具有一定的抑制作用，其抑制程度为枯草芽孢杆菌＞金黄色葡萄球菌＞藤黄微球菌＞大肠埃希菌＞酿酒酵母，整体上对革兰氏阳性菌的抑菌效果优于阴性菌，对霉菌中的桔青霉和米曲霉均具有抑菌作用，抑菌效果与色素的质量浓度呈正相关。这可能与桂花色素主要成分为类黄酮化合物以及类胡萝卜素有关，有研究表明，黄酮类物质可以阻碍细胞膜和细胞壁的生成，抑制ATP的合成，影响菌体代谢[29]。此外，黄酮类物质可与金属形成螯合物，抑制细菌金属酶的活性[30]。李念等[31]发现类胡萝卜素可抑制细胞膜的生成。目前，对于色素中具体的抑菌物质和机理还有待进一步研究。

3 结论

试验选取浦城丹桂、四季桂、状元红、金桂、银桂这5个浦城桂花产量较高的品种提取色素，其中四季桂的色素得率最高，为49.52%。以四季桂为原料，在单因素试验的基础上，选取乙醇浓度、液料比、超声功率、超声时间4个因素进一步进行响应面优化试验，得到桂花色素的最佳提取工艺为乙醇浓度60%、超声功率200 W、超声时间30 min、液料比25∶1 （mL/g）。在此条件下，桂花色素提取率最高，为61.56%，与预测值（61.66%）的相对误差为0.16%，表明响应面优化超声辅助法提取桂花色素的工艺是可行的。桂花色素的抑菌试验结果表明，桂花色素的抑菌效果显著，整体上，桂花色素对革兰氏阳性菌的抑菌效果优于阴性菌。试验中色素的抑菌程度为枯草芽孢杆菌＞金黄色葡萄球菌＞藤黄微球菌＞大肠埃希菌＞酿酒酵母，对桔青霉和米曲霉的抑制作用较弱。桂花色素除了可用于食品着色外，还具有显著的抑菌效应，在食品、药品和化妆品领域中具有极大的开发潜力和广阔的应用前景。

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收稿日期：2023-07-14

基金项目：广西自然科学基金项目（2022GXNSFBA035561）；南宁师范大学博士科研启动基金项目（20210502）；福建省科技厅社会发展引导性项目（2020N0036）

作者简介：谭志梅（1998－），女，硕士，研究方向：食品微生物。

*通信作者：王淑培（1986－），女，讲师，博士，研究方向：食品微生物及生物技术。