PIEZO1影响HaCaT细胞的趋电性迁移*

张桂诚 龚 鹏 王一凡 赵三军

（云南师范大学生命科学学院，昆明 650500）

创伤后修复是一个动态协调过程，需要多基因共同调控程序的表达，主要包括止血炎症、新组织的形成和组织重构或分解三个阶段，在伤口愈合过程中细胞进行分裂分化和运动迁移，而往往迁移要快于分裂分化过程，优先对伤口处进行修复［1］。研究发现，伤口处皮肤屏障缺失导致的跨上皮电位短接会在伤口处产生内源性电场（electric field，EF），这种恒稳微直流电场能够指导细胞向伤口中心定向迁移，在伤口愈合的过程中具有重要作用［2-3］。

上皮损伤后发生机械感知的改变与上皮稳态的缺失，在伤口处形成一定的空隙，机械力环境发生改变，研究表明，此种活动可以通过机械感知离子通道发挥作用，在生物体伤口愈合过程发挥作用［4］。PⅠEZO1 是在哺乳动物中发现的一类广泛分布于包括皮肤在内的各组织器官中的机械敏感离子通道，它能够对剪切应力做出响应，并将机械力转换为生物信号，参与流体压力感知、触摸感觉，维持上皮细胞稳态等生物学过程。PⅠEZO1 参与介导了包括Ca2+在内的多种金属离子的流动，在细胞增殖、分化和迁移过程中感受外界机械信号并在调节细胞运动方式中发挥不可或缺的作用［5-6］。在细胞迁移过程中，PⅠEZO1 在细胞运动前端的片状伪足处积聚，抑制PⅠEZO1 通道可以促进细胞迁移［7］。在盘基网柄菌中应用siRNA敲低Piezo1表达会导致其趋化性迁移的缺陷［6］。研究发现，内源性电场在伤口愈合过程中是重要的细胞迁移方向信号［2］，在小鼠伤口愈合模型研究中发现，PⅠEZO1 参与伤口愈合、趋化性迁移和细胞运动［5］的过程，并且可以切换到纯电压门控模式［8］。但是PⅠEZO1是否参与细胞的趋电性迁移尚不清楚。本研究以人角质形成细胞HaCaT为模型，应用PⅠEZO1的抑制剂以及siRNA 等方式调控PⅠEZO1 活性及表达，研究PⅠEZO1 在细胞感知电信号并进行定向迁移中的作用，并探讨PⅠEZO1 下游相关分子黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）及整合素（integrin）等蛋白质分子对细胞趋电性迁移的影响，为研究细胞趋电性迁移的机理研究提供参考。

猕猴桃，又叫奇异果，基维果，KIWI fruit，胡桃，羊桃，其原产地在中国，在我国的文字记载已有2000余年的历史，然而到了是20世纪初才由野生植株转进为人工驯化栽培，也就是说猕猴桃至今仅有100多年的人工栽培时间。

1 材料

1.1 细胞

人永生化角质细胞（HaCaT）购自中国科学院昆明细胞库，编号KCB 200442YJ。

近年来，随着成人高等教育，成人中等专业学校的发展，已初见高等教育大众化和终身化的趋势。由于人们对社会公平的追求和想要提高精神境界，以及技术更新和发展的要求，高等教育逐步进入大众化和终身化。这是解决结构性失业的根本措施，也可有效的解决适龄人口下降造成高等教育资源闲置的问题。

1.2 主要试剂

胎牛血清（ExCell Bio），DMEM 高糖培养基（上海培源），FNC coating MⅠX（Enzo，AES），Opti-MEM （Gibco） ， LipofectamineTM2000（Thermo）， 钌 红 （ruthenium red， RuR）、GsMTx4、PF562271 均购自MCE，BCA 蛋白质浓度测定试剂盒（GlpBio），FAK、磷酸化FAK、Akt、磷酸化Akt、Ⅰntegrin β1均为兔抗购自CST公司，PⅠEZO1 兔抗（Affinity），GAPDH 兔抗（上海翌圣），β-tubulin 兔抗（Boster），HRP 偶联的山羊抗兔ⅠgG（华安生物），siRNA 由安徽通用生物技术公司合成，integrin β1 的抗体抑制剂P5D2 购自Abcam公司。

1.3 主要器材

研究进一步采取siRNA 干扰Piezo1mRNA 从而降低蛋白质的表达来验证PⅠEZO1对于细胞趋电性迁移中的作用。采用三对不同序列siRNA 和与靶基因无同源性的序列作为阴性对照分别进行瞬时转染实验，PⅠEZO1 蛋白表达量如图4 所示，编码4669的序列显著降低了PⅠEZO1蛋白的表达量。细胞转染后接种于迁移小室（图4），siRNA 干扰后的细胞与阴性对照相比，贴壁细胞状态，呈现为均匀的片状伪足伸展。

2 方法

2.1 细胞培养

HaCaT 细胞复苏后培养于DMEM 完全培养基（89% DMEM高糖培养基，10% FBS，1% 100×青霉素-链霉素），在37℃、5% CO2培养箱中培养，每2~3 d胰酶消化传代1次，待生长至对数期用于实验。

2.2 细胞趋电性迁移

趋电小室（Boyden Chamber） 的制作参考Zhao 等［9］的方法，取直径为 100 mm 的细胞培养皿，使用高真空密封脂将盖玻片（长22 mm、宽10 mm、厚 0.13 mm）固定于培养皿底部中央，制作长为22 mm、宽为10 mm的长方形趋电小室。

取对数期HaCaT细胞进行消化、离心、重悬、稀释至（1~5）×107/L 细胞密度并接种于FNC 包被的趋电小室，待细胞贴壁2 h。根据实验需要采用钌红、GsMTx4、P5D2、PF562271 等孵育1 h 后，在小室两端施加稳定直流电场，强度为100 V/m，置于活细胞工作站中拍摄细胞运动轨迹，间隔5 min拍摄一次，持续2 h。每个处理选取3~5个视野，随机选取细胞合计300个左右，应用ⅠmageJ软件，分析细胞的迁移路径，以细胞迁移的方向性（directedness （cosθ））、轨迹速度（track speed）、位移速度（displacement speed）、方向持续性（euclidian persistence）四个指标为参数，计算细胞趋电性迁移的能力。

2.3 蛋白样品收集

Western blot 结果显示，siRNA 干扰PⅠEZO1 表达后FAK 总蛋白未发生显著性改变，但FAK 的磷酸化水平显著降低，且在PⅠEZO1 表达被干扰后，电场对FAK 的磷酸化的促进作用显著被抑制，同时siRNA 干扰PⅠEZO1 表达后Akt 总蛋白无显著变化，但使其磷酸化水平有小幅度下降，PⅠEZO1 低表达也取消了电场对于Akt磷酸化的促进作用。与此同时电场作用下，总integrin β1蛋白表达量明显升高，而且siRNA干扰PⅠEZO1后，在电场作用下其表达量未明显升高（图6）。

2.4 细胞转染

取对数期HaCaT细胞按照（2~8）×105/孔接种于6 孔细胞培养皿，置于CO2培养箱培养24 h 后进行转染，细胞融合度应为 30%~50%。DEPC 水分装siRNA 干粉，Opti-MEM 稀释siRNA 至50 nmol/L，250 μl Opti-MEM 稀释5 μl LipofectamineTM2000。两者混匀静置20 min后加入6孔板，补加培养基，6 h后更换新鲜培养基培养。转染18~48 h后收集蛋白质样品进行蛋白质印迹（Western blot）验证是否转染成功。

2.5 Western blot

蛋白质样品用BCA 蛋白质浓度测定试剂盒进行蛋白质定量，根据定量结果将蛋白质样品调整至相同浓度，取4%~20%蛋白质分离凝胶，组装电泳架。每孔20 μl蛋白质样品，恒压80 V电泳20 min，后续转恒压100 V 继续电泳。甲醇激活PVDF 膜，组装“三明治”结构进行转膜，条件：电流250 mA，时间120 min。取PVDF 膜浸入预冷的TBST（TBS with Tween-20）缓冲液震荡1 min 后，脱脂奶粉封闭60 min。根据蛋白质大小将目的蛋白条带切出，TBST 漂洗去封闭液，置于一抗4℃过夜孵育。取条带TBST 漂洗10 min，洗3 次，二抗室温孵育1 h，取条带TBST 漂洗10 min，再洗3次。将条带浸泡于新配制的发光液1 min 后取出，用化学成像系统（Tanon 5500 Multi）进行拍摄。

2.6 数据分析与处理

每个实验独立重复3次，每次实验根据细胞数量统计3~5 个视野，共300 个细胞，应用Excel 2016 统计所有细胞实验原始坐标数据，进行统计学分析，数据结果表示为平均值±标准误（Mean±SEM），应用独立性t检验进行显著性分析，较显著差异*P<0.05，显著差异**P<0.01，极显著差异***P<0.001，应用GraphPad Prism 8绘图。

3 结果

3.1 钌红显著抑制HaCaT细胞趋电性迁移

使用抑制剂抑制FAK 后，与对照组相比，方向性降至（0.805±0.005）（P<0.01），降幅为9.5%，趋电性迁移轨迹速度降低至（0.589±0.004）μm/min，降幅超过18%，有显著差异（P<0.001），位移速度显著降低至（0.376±0.003）μm/min（P<0.01），细胞趋电性迁移的方向持续性与对照组并无显著性差异。

GsMTx4是一种蜘蛛毒液肽，是特异性靶向阳离子机械敏感离子通道（mechanosensitive ion channels，MSC）的抑制剂，可以阻碍机械力刺激细胞引起的胞内电流［10］。选用GsMTx4处理细胞，调控PⅠEZO1 通道功能，追踪细胞趋电性迁移轨迹（图2a）。结果显示：在未施加电场时，HaCaT 细胞呈现出向各方向的随机迁移，迁移速度较慢，电场作用下，HaCaT 细胞呈现向电场正极的定向迁移，迁移速度显著增加；用GsMTx4处理细胞抑制PⅠEZO1 功能，HaCaT 细胞向电场正极进行定向迁移的路径呈现更加分散（图2b）。统计分析显示，与未用GsMTx4的对照相比，HaCaT细胞在电场作用下轨迹速度由（0.782±0.008） μm/min 降低为（0.741±0.007）μm/min（n=300，P<0.05），位移速度由（0.529±0.007）μm/min降低至（0.458±0.006）（P<0.001），细胞在沿电场方向迁移的持续性也由（0.652±0.006） 显著降低至（0.594±0.006）（P<0.001）（图2c~e）。

采用Western blot 检测蛋白质的表达量以及磷酸化水平（图3），结果显示：100 V/m直流电场作用下，HaCaT 细胞的Ⅰntegrin β1 表达上调，Akt 和FAK的磷酸化水平也显著上调；GsMTx4单独作用也同样使HaCaT 细胞的Akt 和FAK 的磷酸化水平显著升高；但GsMTx4和电场同时作用下，未出现对Akt 与FAK 磷酸化水平以及integrin β1 表达的叠加促进作用。以上结果表明，GsMTx4 作用于HaCaT 细胞后，在一定程度上抑制了其趋电性迁移，PⅠEZO1 可能在电场指导的细胞趋电性迁移过程中发挥作用。

Fig. 1 Electrotaxis of HaCaT cells treated by ruthenium red

3.2 GsMTx4显著降低HaCaT细胞趋电性迁移的轨迹速度和方向持续性

1.职责不清。目前公职律师的业务范围基本上与法制机构职责重叠，公职律师与法律顾问、其他税收法制人员之间的关系有待理顺，职责划分、管理架构需进一步明确。

Fig. 2 Electrotaxis of HaCaT cells treated by GsMTx4

无机化学是一门以实验为入手和学习的一门课程，在理论课后要用实验去巩固所学习的知识，在做实验的过程中，需要向学生灌输认真细致的实验态度，追求实事求是的结果。实验可以检验课本所教授的知识，同时可以强化理论的学习，巩固理论知识。

Fig. 3 Electric field and GsMTx4 treatment promote the phosophorylation of Akt，FAK and integrin β1

3.3 siRNA干扰PIEZO1表达显著降低HaCaT细胞趋电性方向性和方向持续性

CO2细胞培养箱，活细胞工作站（Zeiss），细胞培养皿（LabServ），蛋白质分离凝胶（上海翌圣），电泳仪（Bio-Rad），直流电源（百晶）。

综上所述，当前我国的环境污染以及土地资源的利用问题比较严重，人们应该引起足够的重视。在经济快去发展的今天，人们生活水平不断提高，但这种现象应该是可持续发展的，所以相关部门应该注意在经济建设的发现过程中注意环境的保护，重视土地资源可持续发展，实现经济的持续、健康的发展。

细胞的趋电性迁移轨迹图（图5a），在电场作用下，阴性对照组HaCaT 细胞趋向正极进行定向迁移；siRNA 干扰PⅠEZO1 后，HaCaT 细胞明显降低了向正极迁移的方向性，且呈现出迁移的轨迹更加分散，说明细胞迁移的方向性受到影响，迁移的能力有所下降。统计结果显示：siRNA干扰后，细胞趋电方向性由（0.805±0.008） 显著降低至（0.514±0.014）（P<0.001），方向持续性由（0.606±0.005）降低到（0.579±0.005），存在较显著差异（P＜0.05）；而siRNA 干扰细胞后，细胞在电场中的迁移速度、位移速度都略微降低，但与对照组相比都无统计学上显著差异存在（图5b~e）。

Fig. 4 Expression of PIEZO1 protein and morphological changes of cells after siRNA interference

Fig. 5 Electrotaxis of HaCaT cells after siRNA interference with PIEZO1

取对数期HaCaT 细胞调整密度，将约3×107个细胞均匀接种于4 cm×3 cm的小室，放入CO2培养箱37℃孵育至完全贴壁（2~4 h），设置4组实验处理。组1：无电场，无药物处理；组2：单独100 V/m电场处理；组3：无电场，单独药物处理；组4：100 V/m 电场加药物处理。处理结束用预冷的PBS快速冲洗3遍，置于冰上加入200 μl配制好的裂解液，裂解5 min，细胞刮板刮下转移至预冷离心管。涡旋振荡2 s后，4℃，13 000 r/min，11 min离心后取上清，置于冰上。

对照组给予常规护理管理措施，包括：24 h开诊，随时应诊；值班护士不得离开接诊室；完善各类抢救器材与药品；对患者具有高度的责任心与同情心；完善各项病历与护理记录；遇重大事故时，需要通知门诊、医务科、护理部与院领导等，并积极向有关部门报告。

现分别从主观权重中抽取l个样本、从客观权重中抽取q-l个样本，即每个评价指标uj(1≤j≤n)有q个权重样本，此时权重集合需满足与q个权重向量的离散值越小越好。此外，对于评价指标，不同主客观权重的重要程度不同，现用α和β分别表示主、客观权重的重要程度系数[21,22]。

PⅠEZO1 下调后细胞趋电性迁移的方向性受到显著影响，暗示PⅠEZO1可能参与细胞定向迁移过程中对方向信号的调控。同时，Akt及FAK的磷酸化水平受到显著抑制，siRNA 干扰PⅠEZO1 表达显著影响电场对Akt及FAK的活化，以上结果暗示电场可能通过PⅠEZO1 调节Akt 及FAK 磷酸化水平调控细胞去电性迁移的方向性。而siRNA 干扰PⅠEZO1 的作用对于电场对Ⅰntegrin β1 表达的上调作用也有所抑制。

Fig. 6 The expression and phosphorylation of FAK，Akt and integrin β1 under electric field after siRNA interfering PIEZO1 expression

3.4 抑制integrin β1或FAK影响HaCaT细胞趋电性迁移

在细胞的定向迁移过程中，整合素在运动方向上呈高度极化状态，细胞迁移过程中负责黏附的整合素经由内吞作用以及胞内转运进行循环周转受到FAK和相关底物的控制［11］。整合素和PⅠEZO1在细胞外基质相互作用，细胞感受机械刺激调节刚度增加需要整合素等相关通路信号的参与［12］。P5D2是一种特异性靶向integrin β1的抗体抑制剂，可用来阻断其功能［13］。 FAK 抑制剂 PF562271（Synonyms）是一种可逆的ATP 竞争性的FAK 和Pyk2 抑制剂，可以抑制FAK Y397 的磷酸化水平［14］。

轨迹图显示（图7a），在integrin β1 抑制剂P5D2 作用下，HaCaT 细胞在电场下的运动轨迹及范围显著缩小，细胞呈现出运动能力的下降，且沿电场方向上进行迁移的方向性降低，HaCaT 细胞趋电性迁移的四个参数均显著下降（图7b~e）。在FAK 抑制剂PF562271 的作用下，细胞向正极方向的迁移轨迹范围有显著缩小，说明其迁移能力有所下降，但定向移动的方向性仍较好。

Fig. 7 The electrotaxis of HaCaT cells under the treatment of integrin β1 antibody inhibitor P5D2 and FAK inhibitor PF562271

统计结果显示：P5D2 作用后HaCaT 细胞在电场中迁移的方向性显著下降，与对照组相比，细胞趋电性迁移的方向性由（0.890±0.004）下降至（0.357±0.014）（P<0.001）下降超过59%。细胞轨迹速度从（0.722±0.005） μm/min， 显著下降到（0.416±0.004）μm/min（P<0.001）；位移速度也呈现相同的差异降低，从（0.494±0.004）μm/min 下降为（0.111±0.002）μm/min（P<0.001）。方向持续性从（0.641±0.003）下降为（0.264±0.004），对照组EF与P5D2处理存在极显著差异（P<0.001）。

钌红是广谱阳离子通道抑制剂，抑制包括PⅠEZO1 在内的多种阳离子通道。从细胞迁移的轨迹图可以看出，未施加电场时HaCaT 细胞呈现随机迁移，在100 V/m的直流电场作用下HaCaT细胞向电场正极快速定向迁移，钌红显著抑制了电场对于细胞迁移的促进和定向作用（图1a）。对细胞迁移各参数分析结果显示，未施加电场时，HaCaT细胞呈向各方向随机迁移，迁移速度较慢，电场作用下，HaCaT 细胞趋电性迁移的方向性、轨迹速度、位移速度和方向持续性显著升高（图1b~e）。钌红显著抑制了HaCaT 细胞的趋电性迁移，其迁移主要参数均显著降低：迁移方向性由（0.907±0.007）显著降低至（0.422±0.018）（P<0.001）；轨迹速度由（0.855±0.007） μm/min 显著降低至（0.636±0.007） μm/min （P<0.001）；位移速度由（0.615±0.007） μm/min 显著降低至 （0.296±0.005） μm/min （P<0.001）；方向持续性也由（0.708±0.005）降低至（0.455±0.006）（P<0.001）。上述结果表明，钌红显著抑制HaCaT 细胞的趋电性迁移，暗示包括PⅠEZO1 在内的阳离子通道可能在细胞的趋电性迁移过程发挥重要作用。

由上述实验结果可得，P5D2抑制integrin β1后显著抑制了HaCaT 细胞的趋电性迁移，其方向性和速度的抑制都较为明显。抑制FAK 影响HaCaT细胞的趋电性迁移，但影响幅度较小。

Western blot 结果显示，P5D2 抑制integrin β1后，FAK 的磷酸化水平有所上调，电场作用下其磷酸化水平一步上升（图8），猜测电场作用下FAK 的活化可能并不被integrin β1 功能抑制所阻碍，仅被电信号引起的生理变化所激活。在P5D2的作用下，磷酸化Akt的水平显著下降，而且电场在P5D2作用下并未改变磷酸化Akt的水平（图8），说明在电信号作用下可以通过integrin β1 调控Akt的活化水平并参与细胞的趋电性迁移。

Fig. 8 Electrotaxis of HaCaT cells under treatment of integrin β1 inhibitor P5D2

4 讨论

在皮肤损伤实验模型发现，在损伤产生的其他因子（如接触抑制释放、趋化因子释放等）同时存在的情况下，伤口处产生的内源性电场，是主导细胞向伤口中心定向迁移，从而促进伤口愈合的重要信号［2］。但细胞迁移过程中响应电信号的关键分子及信号通路尚不清晰。研究发现，PⅠEZO1 可以影响细胞的趋化性迁移［6］，参与细胞运动［5，15-17］，在伤口愈合过程中发挥重要作用［4］，并且Piezo1可被电压门控调节［8］。本研究以HaCaT 细胞为模型研究PⅠEZO1在感知电信号与促进细胞定向迁移中的作用，研究结果显示，抑制或降低PⅠEZO1表达，HaCaT 细胞在电场中的定向迁移方向性参数以及速度参数受到不同程度的抑制。尤其是通过RNAi 技术敲低PⅠEZO1 后，细胞趋电性迁移显著下降，这与在盘基网柄菌中低表达Piezo1趋化性受到抑制的实验结果一致，在方向信号cAMP的作用下，Piezo1参与调控细胞定向迁移的方向性，而对迁移的速度影响甚微，细胞在电场信号作用下有同样的结果。以上提示PⅠEZO1对细胞迁移方向性的重要性［6］。因此，PⅠEZO1 可能参与细胞感知外界电场信号影响细胞的趋电性迁移从而促进伤口愈合的过程。

本研究中所采用了两种抑制剂分别抑制PⅠEZO1 的活性，结果显示，广谱抑制剂钌红作用下细胞趋电性迁移的速度、方向性及方向持续性等参数均呈现极显著下降，而抑制剂GsMTx4作用下细胞趋电性迁移的速度及方向持续性有显著下降，造成以上结果的原因可能是由于广谱抑制剂钌红作用主要阻断部分Ca2+、Na+通道［18］，可以抑制包括PⅠEZO1 介导Ca2+电流。而抑制剂GsMTx4 是选择性地抑制PⅠEZO 和TRP 通道家族阳离子的机械敏感性通道，还可阻断阳离子选择性的拉伸激活通道（SAC）［19］。已有研究证明，Ca2+在细胞迁移过程中具有重要作用［20］，广谱抑制剂钌红对细胞趋电性迁移的显著抑制作用可能是通过阻断PⅠEZO1 介导的Ca2+流发挥作用。

本研究结果显示，电场显著促进HaCaT 细胞integrin β1的表达和FAK磷酸化水平的上升，这与电场诱导升高integrin β1的mRNA或蛋白质水平激活FAK 的磷酸化进而促进人视网膜色素上皮细胞迁移［21］和在人晶状体上皮细胞的上皮-间充质转换［22］的研究报道相符合。电场作用还可以活化上调PⅠ3K/Akt 途径启动细胞反应，如迁移、增殖和分化［23］。本研究应用GsMTx4抑制剂及RNAi方式敲低PⅠEZO1 的表达均抑制电场对HaCaT 细胞integrin β1 表达的促进，这表明电场作用促进integrin β1 表达上调的过程是通过PⅠEZO1 介导，同时敲低PⅠEZO1也抑制了FAK磷酸化，且FAK不能被电场进一步激活，这显示电场对FAK 的活化作用受到PⅠEZO1 水平的调节。但PⅠEZO1 响应电场的具体机制以及是否直接调节integrin β1和FAK影响细胞趋电性迁移仍待进一步实验研究。

应用抗体抑制剂P5D2 阻断integrin β1 的功能与抑制剂PF562271来抑制FAK的功能，PⅠEZO1下游的integrin β1和FAK在不同程度上影响HaCaT细胞的趋电性迁移。暗示细胞对趋电性迁移方向的调控可能是通过PⅠEZO1 影响FAK 的磷酸化和integrin β1表达来传递电场信号。

5 结论

PⅠEZO1 参与HaCaT 细胞的趋电性迁移，是影响HaCaT 细胞趋电性迁移的重要分子之一；抑制integrin β1和FAK会影响HaCaT细胞的趋电性迁移过程，integrin β1 与FAK 可能与PⅠEZO1 介导细胞感应电场的信号通路有关，电场信号可能通过PⅠEZO1介导参与integrin β1和FAK的调控过程。

分析问卷数据了解到，住宅为一层的比例为78%，住宅为二层的比例为22%；住宅围护结构为砖房的比例为92%，土房比例为8%，说明一层砖房为北方农村住宅的典型形式。