敲低CD73 的表达对人肺腺癌H1975 细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响及其机制△

肖文华，黄真，刘凤娟，张弘，苏红，孙荣丽

1 青岛大学青岛医学院，山东 青岛 266042 康复大学青岛中心医院（青岛市中心医院）2 院长办公室，3 药物临床试验中心一期病房，4 呼吸与危重症医学科，5 基层医疗科，山东 青岛 266042

中国国家癌症中心统计报告显示，肺癌是中国发病率和病死率最高的恶性肿瘤[1]。肺癌的常见病理类型为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），NSCLC 中又以肺腺癌最为多见，占所有NSCLC 病理类型的50%以上，且呈持续上升趋势[2]。肺腺癌患者的病死率一直处于较高水平，中晚期肺腺癌患者的5 年生存率不足20%[3]。CT 等影像学检查的普及明显提高了早期肺癌的诊断率，降低了病死率，但对于中晚期肺癌患者无明显受益[4]。近年来，随着免疫检查点的发现及免疫检查点抑制剂的应用，患者的预后和生活质量得到了明显改善，且不良反应发生风险较低，表明免疫治疗具有良好的发展前景[5-6]。尽管如此，仍然有一部分患者不能从现有的免疫治疗中获益。因此，积极探索新的潜在治疗靶点至关重要。胞外5’-核苷酸酶（5’-nucleotidase ecto，NT5E），又称为CD73，是一种多功能跨膜糖蛋白，参与细胞外腺苷的生成，与免疫、炎症和肿瘤等多种病理、生理反应相关[7]。有研究表明，CD73 在多种肿瘤中高表达，且患者大多预后不良[8-11]，但其促进肿瘤发生、发展的具体作用机制尚未完全清楚，特别是CD73 促进肺腺癌发生发展的机制鲜有报道。本研究探讨敲低CD73的表达对人肺腺癌H1975 细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响，并进一步探索其可能的机制，以期为肺腺癌的发生、发展机制和治疗方法的研究提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 细胞和试剂

人肺腺癌H1975 细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。慢病毒HBLV-ZsGreen-PURO 购自上海汉恒科技公司。胎牛血清购自以色列Biological Industries 公司，Matrigel 基质胶、RPMI 1640 培养基、Transwell 细胞培养小室均购自美国Corning公司，CD73、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）p85a 抗体均购自英国Abcam 公司，磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）抗体均购自美国ImmunoWay 公司，磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司，E-上皮钙黏素（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗体均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。本研究经过青岛市中心医院医学伦理委员会审批通过（KY202217502）。

1.2 人肺腺癌H1975 细胞培养与转染

将人肺腺癌H1975 细胞培养在含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗的RPMI 1640 完全培养基中，置于37 ℃、5% CO2的恒温箱中常规培养。细胞消化离心后置入完全培养基重悬，配制1.5×105/ml 的细胞悬液，并加入6 孔板中（每孔接种1 ml）。待细胞密度生长至50%左右，将原培养基弃去，每孔加入5 µg/ml 聚凝胺混合培养基1 ml。然后每孔加转染慢病毒60µl[感染复数（multiplicity of infection，MOI）=40]，4 h 后将混合培养基补齐至2 ml。转染24 h 后弃去含病毒的培养基，换为新鲜完全培养基，置于培养箱中继续培养。转染72 h 后置于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，若细胞状态稳定，换上浓度适当的含嘌呤霉素（本研究嘌呤霉素浓度为3 µg/ml）的新鲜完全培养基进行筛选培养，待无明显细胞死亡后视为未转染的正常细胞已全部杀死，此时更换新的完全培养基继续培养，定期重复筛选。将转染慢病毒HBLV-ZsGreen-PURO NC 的人肺腺癌H1975细胞作为H1975-NC 组，将转染3 种不同位点敲低CD73表达的慢病毒HBLV-h-CD73短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）-ZsGreen-PURO 的人肺腺癌H1975 细胞分别作为H1975-shCD73-1 组、H1975-shCD73-2 组、H1975-shCD73-3 组，以未转染人肺腺癌H1975 细胞作为空白对照组。

1.3 蛋白质印迹法（Western blot）筛选敲低效果最明显的转染细胞

分别收集空白对照组、H1975-NC 组、H1975-shCD73-1 组、H1975-shCD73-2 组、H1975-shCD73-3组细胞至1.5 ml 离心管中，加入适量的放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液和苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）混合液（100∶1）于冰上裂解30 min 后低温离心，取上清液，加入适量蛋白上样缓冲液置于100 ℃金属浴锅中加热10 min，提取总蛋白后进行电泳，然后转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，封闭后加入适量抗体溶液进行孵育（抗体溶液根据说明书进行稀释），然后将配制的发光液滴加在PVDF 膜条带上，于暗室内进行曝光处理。曝光结束后采用ImageJ 软件分析蛋白条带相对灰度。选取敲低效果最明显的转染细胞进行后续实验，作为H1975-sh 组。

1.4 CCK8 法检测细胞增殖能力

选取H1975-NC、H1975-sh 组细胞，制备浓度为5×104/ml 的细胞悬液。接种至6 孔板中，每孔中加入100µl 细胞悬液，加入100µl 完全培养基培养4、24、48、72 h 后，每孔加入10 µl CCK8 溶液，置于培养箱中静置培养2 h，采用酶标仪检测H1975-NC、H1975-sh 组细胞450 nm 处的吸光度（optical density，OD）值，酶标仪以H1975-NC 组为对照调零。

1.5 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

选取H1975-NC 组、H1975-sh 组细胞加入至6孔板中，并接种等量细胞（H1975-sh 组细胞可适当增加接种量）置于培养箱中培养，显微镜下观察到6 孔板内长满细胞后消毒，用200 µl 枪头沿直尺垂直底部横线从顶部向底部划线。然后每孔加入2 ml 含1%胎牛血清的RPMI 1640 培养基后于镜下拍照，拍照完毕后继续于培养箱中培养，分别在培养24、48 h 时再次于镜下拍照，观察细胞迁移情况。

1.6 Transwell 实验检测细胞侵袭能力

将Matrigel 胶加入RPMI 1640 培养基按照1∶40 稀释，每个细胞培养小室中加入100 µl 稀释好的Matrigel 胶，置于培养箱中静置4 h 后取出，吸走小室内未凝固的培养液，每个小室下方加入600 µl 完全培养基。收集H1975-NC 组、H1975-sh组细胞，用不含血清的RPMI 1640 培养基制备浓度为2.5×105/ml 的细胞悬液，每个小室内加入200 µl 细胞悬液，每个实验组设置3 个复孔，然后将孔板继续置于培养箱中培养。培养16 h 后将孔板拿出，将小室浸入甲醇溶液中固定细胞，然后用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）清洗风干后将小室浸入0.1%结晶紫溶液中染色，染色完成后用PBS 冲洗2 次，再将小室倒置晾干。最后将小室放在载玻片上置于显微镜下观察，随机选择5 个视野进行拍照并计算侵袭细胞数目。

1.7 Western blot 检测上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、PI3K/AKT 信号通路标志蛋白的表达水平

Western blot 检测方法同1.3 部分，检测H1975-NC 组、H1975-sh 组EMT 通路标志蛋白E-cadherin、vimentin 的表达水平以及PI3K/AKT 信号通路标志蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 的表达水平，计算p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT。

1.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验；以P﹤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot 检测细胞CD73 表达情况

慢病毒CD73shRNA 分别转染人肺腺癌H1975 细胞后，荧光显微镜下观察到稳定表达绿色荧光即表示转染成功，通过嘌呤霉素筛选转染成功细胞并杀死未转染细胞，稳定传代进行后续实验（图1）。采用Western blot 检测空白对照组、H1975-NC 组、H1975-shCD73-1 组、H1975-shCD73-2 组、H1975-shCD73-3 组的CD73 表达情况，结果显示，5 组细胞的CD73 表达情况比较，差异有统计学意义（P﹤0.01），其中H1975-shCD73-2 组细胞CD73敲低效果最明显，选取该组（即H1975-sh 组）细胞进行后续实验。（图1、图2、表1）

图1 荧光显微镜显示慢病毒CD73 shRNA转染人肺腺癌H1975细胞

图2 Western blot检测各组人肺腺癌H1975细胞CD73表达情况

表1 各组人肺腺癌H1975 细胞CD73 蛋白表达水平的比较（±s）

表1 各组人肺腺癌H1975 细胞CD73 蛋白表达水平的比较（±s）

组别空白对照组H1975-NC组H1975-shCD73-1组H1975-shCD73-2组H1975-shCD73-3组F值P值CD73蛋白表达水平0.942±0.053 0.887±0.047 0.446±0.063 0.312±0.049 0.513±0.145 36.23<0.01

2.2 敲低CD73 的表达对人肺腺癌H1975 细胞增殖能力的影响

采用CCK8 实验检测H1975-NC 组、H1975-sh组细胞的增殖能力，结果显示，转染4 h，H1975-NC组细胞与H1975-sh 组细胞OD 值比较，差异无统计学意义（P﹥0.05）；转染24、48、72 h，H1975-sh 组细胞OD 值均明显低于H1975-NC 组细胞，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（表2）

表2 转染不同时间H1975-NC组、H1975-sh组细胞OD值的比较

2.3 敲低CD73 的表达对人肺腺癌H1975 细胞迁移能力的影响

采用细胞划痕实验检测H1975-NC、H1975-sh组细胞迁移能力，结果显示，培养24、48 h，H1975-sh组细胞的划痕面积愈合率分别低于H1975-NC 组细胞，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（表3、图3）

图3 转染不同时间H1975-NC组、H1975-sh组细胞迁移情况

表3 转染不同时间H1975-NC 组、H1975-sh 组细胞划痕面积愈合率的比较

2.4 敲低CD73 的表达对人肺腺癌H1975 细胞侵袭能力的影响

采用Transwell 侵袭实验检测H1975-NC 组、H1975-sh 组细胞侵袭能力，结果显示，转染16 h后，H1975-sh 组细胞侵袭数目为（146±15），少于H1975-NC 组细胞的（254±22），差异有统计学意义（t=7.176，P﹤0.05）。（图4）

图4 Transwell侵袭实验检测H1975-sh组、H1975-NC组细胞侵袭情况

2.5 敲低CD73 的表达对EMT 通路标志蛋白E-cadherin、vimentin 表达的影响

Western blot 检测各组人肺腺癌H1975 细胞EMT 通路标志蛋白的表达情况，结果显示，空白对照组、H1975-NC 组、H1975-sh 组细胞E-cadherin、vimentin 蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P﹤0.01）；其中H1975-sh 组细胞E-cadherin 蛋白的相对表达量高于空白对照组和H1975-NC 组细胞，差异均有统计学意义（t=20.95、10.62，P﹤0.05）；H1975-sh 组细胞vimentin 蛋白的相对表达量低于空白对照组和H1975-NC 组细胞，差异均有统计学意义（t=31.30、7.77，P﹤0.05）。（表4）

表4 各组人肺腺癌H1975 细胞EMT 通路标志蛋白E-cadherin、vimentin 相对表达量的比较（±s）

表4 各组人肺腺癌H1975 细胞EMT 通路标志蛋白E-cadherin、vimentin 相对表达量的比较（±s）

组别空白对照组H1975-NC组H1975-sh组F值P值E-cadherin蛋白0.216±0.033*0.394±0.110*1.214±0.076 134.50<0.01 vimentin蛋白1.000±0.034*0.732±0.138*0.091±0.037 91.03<0.01

注：*与H1975-sh组细胞比较，P<0.05

2.6 敲低CD73 的表达对PI3K/AKT 通路蛋白表达情况的影响

采用Western blot 检测H1975-NC 组、H1975-sh组人肺腺癌H1975 细胞PI3K/AKT 信号通路蛋白的表达情况，结果显示，H1975-sh组细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 均低于H1975-NC 组细胞，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（表5）

表5 H1975-NC 组、H1975-sh 组人肺腺癌H1975 细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 的比较（±s）

表5 H1975-NC 组、H1975-sh 组人肺腺癌H1975 细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 的比较（±s）

组别H1975-NC组H1975-sh组t值P值p-PI3K/PI3K 1.298±0.322 0.416±0.211 2.33 0.017 p-AKT/AKT 2.485±0.805 0.694±0.364 7.33 0.042

3 讨论

肺癌严重危害人类健康，是全球肿瘤相关死亡的主要原因之一，其发病率和病死率均呈上升趋势[12]。由于吸烟、职业危害、人口老龄化及环境等因素的影响，肺癌发病率居高不下。尽管现有治疗手段较前已经取得了非常大的进展，但肺癌仍是中国发病率和病死率最高的恶性肿瘤，确诊时已发生远处转移的晚期肺癌患者的5 年生存率仅为6%[13-15]。新靶点的发现和免疫治疗的出现将肺癌患者的5 年生存率提升至15%～50%[15]，明显延长了晚期肺癌患者的生存时间。尽管如此，也只有部分患者能从中获益。因此，探索新的潜在治疗靶点和进一步明确肺癌的发生、发展机制尤为重要。

CD73 可将腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）水解为腺苷后与其受体结合，通过降低T 细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞等免疫细胞的免疫活性来减少免疫因子，增强主要免疫抑制因子的活性，从而引起免疫抑制，促进肿瘤的发生、发展[10]。此外，CD73 还可充当黏附分子，可以调节细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的相互作用，从而促进肿瘤细胞的侵袭、转移[16]。CD73 在多种肿瘤中高表达，说明其对肿瘤的发生、发展发挥重要作用，但具体机制仍有待进一步探索。

EMT 是各种生理、病理过程中的重要环节，与胚胎和器官的生长发育、组织再生和纤维化、肿瘤进展和肿瘤干细胞特性密切相关[17]。EMT 过程中，上皮相关基因E-cadherin的表达受到抑制，而间质相关基因vimentin的表达增强[18]，且受到诸多如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、WNT/β-catenin、Notch、Hedgehog 和受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）等信号通路的共同调节[18-19]。有研究表明，PI3K/AKT 信号通路可促进EMT 的发生并导致肿瘤进展[20-23]，但CD73 是否能促进肺腺癌EMT 的发生及其具体机制目前尚不完全清楚。

本研究探讨CD73 在肺腺癌细胞中的生物学作用及其机制，利用慢病毒CD73shRNA 转染人肺腺癌H1975 细胞构建CD73敲低细胞株，选取CD73敲低效果最明显的细胞进行后续细胞增殖、迁移、侵袭实验，结果显示，敲低CD73的表达后，人肺腺癌H1975 细胞的增殖、迁移和侵袭能力均受到抑制，说明CD73可以促进肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。为进一步探讨CD73 促进肿瘤细胞发生发展的具体机制，本研究采用Western blot检测各组细胞上EMT 通路上皮标志蛋白E-cadherin、间质标志蛋白vimentin 以及PI3K/AKT 信号通路标志蛋白的表达差异，结果显示，H1975-sh 组细胞E-cadherin 蛋白的相对表达量高于空白对照组和H1975-NC 组细胞，vimentin 蛋白的表达量低于空白对照组和H1975-NC 组细胞，差异均有统计学意义（P﹤0.05），表明敲低CD73的表达促进了E-cadherin 蛋白的表达，抑制了vimentin 蛋白的表达，从而表明敲低CD73的表达抑制了肺腺癌细胞EMT 的发生；此外，PI3K/AKT 磷酸化程度反映该信号通路的激活程度，本研究结果显示，H1975-sh组细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 均低于H1975-NC 组细胞，表明CD73 可能通过PI3K/AKT 信号通路促进肺腺癌EMT 的发生，进而导致肺腺癌进展。

综上所述，CD73 能促进肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与PI3K/AKT 信号通路和EMT 过程有关。