葡萄籽原花青素提取物对心肌梗死大鼠肾素－血管紧张素系统及AQP2蛋白表达的影响

郭华　武报佳　邢慧敏　赵睿　孙波　马冬　张丽娜

摘要 目的：探讨葡萄籽原花青素提取物（GSPE）对心肌梗死大鼠肾素血管紧张素－系统及水通道蛋白2（AQP2）表达的影响。方法：将55只无特定病原体（SPF）级Sprague－Dawley（SD）大鼠按照随机数字表法分为健康组、模型组、辛伐他汀组、GSPE低剂量组及GSPE高剂量组，每组11只。除健康组外其余大鼠均采用冠状动脉结扎法制备心肌梗死模型，建模成功后，GSPE低剂量组、高剂量组大鼠分别灌胃100 mg/kg、400 mg/kg葡萄籽原花青素溶液，辛伐他汀组灌胃40 mg辛伐他汀溶液。苏木精－伊红（HE）染色后观察心肌组织形态；末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端转移酶标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡；超声心动图监测心功能；放射免疫法检测血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、血浆肾素活性（PRA）、醛固酮水平；免疫印迹法检测心肌组织中AQP2、B细胞淋巴瘤/白血病2号基因（Bcl－2）及半胱天冬氨酸蛋白酶－3（Caspase－3）蛋白水平。结果：与健康组比较，模型组大鼠左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室舒张末期内径（LVEDD）升高，左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短分数（LVFS）降低（P＜0.05）；与模型组比较，GSPE低剂量组、GSPE高剂量组及辛伐他汀组LVEDD、LVESD降低，LVEF、LVFS升高（P＜0.05），GSPE低剂量组、GSPE高剂量组间比较差异有统计学意义，而GSPE高剂量组与辛伐他汀组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与健康组比较，模型组大鼠AngⅡ、PRA、醛固酮升高（P＜0.05）；与模型组比较，GSPE低剂量组、GSPE高剂量组及辛伐他汀组AngⅡ、PRA、醛固酮降低（P＜0.05）。健康组、模型组、GSPE低剂量组、GSPE高剂量组及辛伐他汀组的心肌细胞凋亡率分别为（5.11±0.33）%、（46.22±3.97）%、（28.46±3.77）%、（15.42±2.33）%及（16.34±2.57）%，各組比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与健康组比较，模型组大鼠心肌组织中AQP2、Caspase－3蛋白水平升高，Bcl－2蛋白水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，GSPE低剂量组、GSPE高剂量组、辛代他汀组大鼠心肌组织中AQP2、Caspase－3蛋白水平降低，Bcl－2蛋白水平升高（P＜0.05）。结论：GSPE对心肌梗死有保护作用，可改善心功能水平，减少心肌细胞凋亡，其作用机制可能与调控AQP2蛋白表达有关。

关键词 心肌梗死；葡萄籽原花青素提取物；水通道蛋白2；肾素－血管紧张素系统；大鼠；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.01.011

Effect of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Renin－angiotensin System and AQP2 Protein Expression in Rats with Myocardial Infarction

GUO Hua， WU Baojia， XING Huimin， ZHAO Rui， SUN Bo， MA Dong， ZHANG Lina

Jizhong Energy North China Medical Health Group Fengfeng General Hospital， Handan 056200， Hebei， China， E－mail： jiqueluan96170@163.com

Abstract Objective：To study the effect of grape seed proanthocyanidin extract （GSPE） on the renin－angiotensin system and aquaporin－2（AQP2） protein expression in myocardial infarction（MI） rats.Methods：Fifty－five specific pathogen free（SPF） Sprague－Dawley rats were randomly divided into healthy group，model group，simvastatin group，low－dose GSPE group，and high－dose GSPE group，with 11 rats in each group.Except for the healthy group，the other rats were prepared by coronary artery ligation to establish the MI model.After successful modeling.the rats in low－ and high－dose GSPE groups were orally administered with GSPE solution at doses of 100 mg/kg and 400 mg/kg，respectively.The rats in simvastatin group were orally administered with 40 mg simvastatin solution.Hematoxylin－eosin（HE） staining was used to observe the morphology of myocardial tissue.Terminal deoxynucleotidyl transferase－mediated dUTP nick end labeling（TUNEL） assay was used to detect myocardial cell apoptosis.Echocardiography was used to monitor cardiac function.Radioimmunoassay was used to detect angiotensin Ⅱ（Ang Ⅱ），plasma renin activity（PRA），and aldosterone levels.Immunoblotting was used to detect the protein levels of AQP2，B－cell lymphoma/leukemia－2（Bcl－2），and Caspase－3 in myocardial tissue.Results：Compared with the healthy group，the left ventricular end－diastolic diameter（LVEDD） and left ventricular end－systolic diameter（LVESD） of rats in model group  increased，while the ejection fraction（LVEF） and fractional shortening（LVFS） decreased（P＜0.05）.Compared with model group，LVEDD and LVESD in low－ and high－dose GSPE groups and simvastatin group decreased，while LVEF and LVFS  increased（P＜0.05）.There were differences between low－ and high－dose GSPE groups，but no significant difference between high－dose GSPE group and simvastatin group（P＞0.05）.Compared with healthy group，the levels of Ang Ⅱ，PRA，and aldosterone in model group increased（P＜0.05）.Compared with model group， the levels of Ang Ⅱ，PRA，and aldosterone in low－ and high－dose GSPE groups and simvastatin group decreased（P＜0.05）.The apoptosis rates of myocardial cells in healthy group，model group，low－dose GSPE group，high－dose GSPE group，and simvastatin group were （5.11±0.33）%， （46.22±3.97）%，（28.46±3.77）%，（15.42±2.33）%，and （16.34±2.57）%，respectively，with statistically significant differences between the groups（P＜0.05）.Compared with healthy group，the levels of AQP2 and Caspase－3 proteins in myocardial tissue of rats in model group  increased，while the level of Bcl－2 protein  decreased（P＜0.05）.Compared with model group，the levels of AQP2 and Caspase－3 proteins in myocardial tissue of rats in low－dose GSPE group，high－dose GSPE group，and simvastatin group  decreased，while the level of Bcl－2 protein  increased （P＜0.05）.Conclusion：GSPE shows a protective effect on MI，which can improve cardiac function， reduce myocardial cell apoptosis，and its mechanism may be related to the regulation of AQP2 protein expression.

Keywords myocardial infarction; grape seed proanthocyanidin extract; aquaporin－2， AQP2; renin－angiotensin system; rats; experimental study

心肌梗死是指冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所导致的心肌坏死，心脏自身供血渠道因各种原因阻塞，心肌组织出现供氧和需氧失衡，导致心肌坏死［1－2］。病人常见症状表现为乏力、胸部不适、心悸、气促、烦躁、心前区疼痛等［3－4］。葡萄籽原花青素是从葡萄籽中提取的一种含有大量酚羟基的多酚化合物，是由儿茶素或表儿茶素聚合而成。研究指出，葡萄籽原花青素提取物（GSPE）在抗细胞凋亡、抗血栓形成、抗氧化应激、心血管保护效应等方面均具有重要作用［5］，但目前有关GSPE在心肌梗死中的研究文献相对较少。心肌梗死病人心室重构会启动肾素－血管紧张素系统（RAS），其中血管緊张素Ⅱ（AngⅡ）的作用较为重要，可通过对细胞作用影响心脏功能。AngⅡ与其受体结合引起全身的微动脉、静脉收缩，血压升高，回心血量增多，会增加交感缩血管纤维递质释放，使交感缩血管中枢紧张，刺激肾上腺合成和释放醛固酮［6］。AngⅡ可调节血液代谢以及血压激素，对心血管肾病内分泌疾病的诊断和治疗有着重要的意义。心肌梗死病人常伴有肾功能不全，肾功能损伤主要表现为水重吸收异常等，水通道蛋白2（AQP2）在肾脏水的重吸收中发挥主要作用。研究表明AQP2蛋白表达在充血性心力衰竭动物模型中增加，提示AQP2蛋白表达在充血性心力衰竭的水潴留中起着关键作用［7］。本研究探讨GSPE对心肌梗死大鼠肾素－血管紧张素系统及AQP2蛋白表达的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

无特定病原体（SPF）级Sprague－Dawley（SD）大鼠，2～4月龄，体质量210～225（213.25±12.37）g，购自亿鸣复兴（北京）公司，动物合格证编号：SCSK（京）2017－0004，饲养7 d后开始实验，大鼠常规饲养，室温维持在23.3～27.2 ℃  ，相对湿度在51%～62%，保持12 h光照，正常饮食、饮水。

1.2 实验仪器及试剂

辛伐他汀购自山东罗欣药业集团股份有限公司，国药准字H20065120；GSPE95%购自西安耀康源生物科技有限公司，货号：YKY－0197；戊巴比妥钠购自上海新亚药业有限公司，国药准字H31021725；青霉素购自上海易佰聚经贸有限公司，货号1031；末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端转移酶标记法（TUNEL）试剂盒购自翌声生物科技（上海）股份有限公司，货号：40308ES20；AQP2抗体购自爱必信（上海）生物科技有限公司，货号：abs137041；B细胞淋巴瘤/白血病2号基因（Bcl－2）购自美国BioVision公司，货号：3033－100；半胱天冬氨酸蛋白酶－3（Caspase－3）抗体购自美国BioVision公司，货号：3004－100；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体，购自北京百奥莱博科技有限公司，货号：F050322；小动物呼吸机购自美国Kent公司；BK－1200全自动生化分析仪，购自山东BIOBASE公司；Allegra X－30高速离心机，购自美国贝克曼库尔特公司。

1.3 分组及心肌梗死大鼠模型的建立

将55只大鼠按照随机数字表法分为健康组、模型组、辛伐他汀组、GSPE低剂量组及GSPE高剂量组，每组11只。除健康组外，其余大鼠采用冠状动脉结扎法制备心肌梗死模型，具体方法参照文献［8］制作：戊巴比妥钠麻醉，固定于手术台上，插入气管，链接小动物呼吸机，监测心电图。于大鼠胸部左侧第3肋与第4肋骨切开，扩开胸腔，暴露心脏，打开心包，于主动脉根部2～3 mm处用6－0丝线穿过，结扎。待心肌颜色变浅、苍白，且心电图显示≥2个导联ST段呈弓背向上抬高认为建模成功，术后给予青霉素抗感染治疗。

1.4 给药方法

建模后次日，GSPE低剂量组大鼠灌胃100 mg/kg GSPE溶液，GSPE高剂量组大鼠灌胃400 mg/kg GSPE溶液，辛伐他汀组灌胃40 mg辛伐他汀溶液，每日1次，连续干预30 d。健康组及模型组灌胃等体积的生理盐水。

1.5 心脏结构与功能指标检测

末次灌胃后，各组大鼠以1%戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后固定于恒温手术板上，胸前区备皮，MP150多通道监测，应用超声心动图仪检查心脏结构和功能。超声仪获取左心室长轴和乳头肌水平短轴切面。检查指标包括左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短分数（LVFS）。

1.6 检测血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、 血浆肾素活性（PRA）、醛固酮水平

各组大鼠处死前，从心脏取血5 mL，1 250 r/min离心5 min，取上清，采用放射免疫法检测AngⅡ、PRA和醛固酮水平，具体操作方法严格按照试剂盒按说明书进行。

1.7 苏木精－伊红（HE）染色观察大鼠心肌组织形态学

各组大鼠处死后取心脏组织，洗净，切取部分心肌组织，置于4%甲醛缓冲液中固定，石蜡切片，脱蜡，乙醇水合处理，洗涤后进行染色，光镜下观察。

1.8 TUNEL检测各组大鼠心肌细胞凋亡率

取各组心肌组织，切片浸入TUNEL反应液中，磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗。过氧化氢冲洗淬灭酶活性，后联合抗生物蛋白过氧化氢酶和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜覆盖，光学高倍显微镜下观察凋亡细胞核呈现棕黄色，随机选择5个视野下的凋亡细胞进行计数。

1.9 蛋白免疫印迹法检测AQP2、Bcl－2及Caspase－3蛋白表達水平

取各组大鼠心肌组织，胰酶消化，离心，取上清液。放入样孔中，进行电泳实验。电泳后将样品转至PVDF膜上，清洗样品，将其放置在三倍磷酸缓冲盐水－Tween 20（TBST）溶液中室温下混匀10 min，封闭蛋白1 h后，将其置于4 ℃环境孵育过夜。将一抗AQP2、Bcl－2及Caspase－3以1∶500和二抗1∶2 500孵育45 min，TBST溶液将蛋白样品清洗3次，凝胶成像系统曝光成像后进一步分析。

1.10 统计学处理

应用SPSS 23.0统计学软件分析数据，符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD－t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心脏结构和功能指标变化

与健康组比较，模型组大鼠LVEDD、LVESD升高，LVEF、LVFS降低（P＜0.05），与模型组比较，GSPE低剂量组大鼠LVEDD、LVESD降低，LVEF、LVFS升高（P＜0.05），与GSPE低剂量组比较，GSPE高剂量组大鼠LVEDD、LVESD降低，LVEF、LVFS升高（P＜0.05），GSPE高剂量组与辛伐他汀组比较，LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见表1。

2.2 各组大鼠血清AngⅡ、PRA、醛固酮水平比较

与健康组比较，模型组大鼠血清AngⅡ、PRA、醛固酮水平升高（P＜0.05），与模型组比较，GSPE低剂量组大鼠血清AngⅡ、PRA、醛固酮水平降低（P＜0.05），与GSPE低剂量组比较，GSPE高剂量组大鼠血清AngⅡ、PRA、醛固酮水平降低（P＜0.05），GSPE高剂量组AngⅡ、PRA、醛固酮水平低于辛伐他汀组（P＜0.05）。详见表2。

2.3 各组大鼠心肌组织形态学比较

与健康组比较，模型组大鼠心肌纤维杂乱无章，心肌细胞坏死，有炎性细胞浸润；GSPE低剂量组、GSPE高剂量组及辛伐他汀组大鼠心肌纤维、心肌细胞坏死有所改善。详见图1。

2.4 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较

健康组、模型组、GSPE低剂量组、GSPE高剂量组及辛伐他汀组的心肌细胞凋亡率分别为（5.11±0.33）%、（46.22±3.97）%、（28.46±3.77）%、（15.42±2.33）%及（16.34±2.57）%，各组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与健康组比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡率升高（P＜0.05），与模型组比较，GSPE低剂量组心肌细胞凋亡率降低（P＜0.05），与GSPE低剂量组比较，GSPE高剂量组大鼠心肌细胞凋亡率降低（P＜0.05），GSPE高剂量组与辛伐他汀组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组心肌细胞凋亡情况见图2。

2.5 各组大鼠心肌组织AQP2、Bcl－2、Caspase－3蛋白表达水平比较

与健康组比较，模型组大鼠心肌组织中AQP2、Caspase－3蛋白水平升高，Bcl－2蛋白水平降低（P＜0.05）。与模型组比较，GSPE低剂量组大鼠心肌组织中AQP2、Caspase－3蛋白水平降低，Bcl－2蛋白水平升高（P＜0.05）。与GSPE低剂量组比较，GSPE高剂量组大鼠心肌组织中AQP2、Caspase－3蛋白水平降低，Bcl－2蛋白水平升高（P＜0.05）。与GSPE高剂量组比较，辛伐他汀组AQP2蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl－2、Caspase－3蛋白水平差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表3、图3。

3 讨 论

近年来，我国心肌梗死发病率呈上升趋势，每年新发约50万例，随着人口老龄化加剧，心肌梗死发病率还有逐渐升高趋势，严重威胁病人生命安全。GSPE是从葡萄籽中提取出来的一种天然化合物，主要成分有原花青素，是强抗氧化活性的多酚化合物，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗炎症等多种功效。本研究探讨GSPE对心肌梗死大鼠肾素－血管紧张素系统及AQP2蛋白表达的作用机制，为相关研究提供参考依据。

心肌梗死后缺血性应激促使梗死边缘的心肌细胞凋亡数量增加，阻碍心功能恢复，造成心室重构等，所以减少心肌细胞凋亡的发生对于保护心脏功能、改善病人生存质量具有重要意义。Bcl－2是细胞抗凋亡因子，Caspase－3是细胞凋亡因子，激活凋亡因子可促进心肌细胞凋亡［9］。西医治疗急性心肌梗死主要采取抗凝、抗血小板聚集等常规方法，辛伐他汀是近年来常用药物，具有调脂、抗炎、改善内皮功能的作用，但临床上仍有部分病人无法获益。

本研究结果表明，在经过GSPE干预后，心肌细胞凋亡减少，且呈现剂量依赖性，这一结果也证实GSPE可抑制心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡。GSPE是天然的多酚化合物，具有抑制炎症反应、细胞凋亡、活血化瘀等作用，目前，已有研究证实其治疗心力衰竭大鼠效果显著。研究发现GSPE具有抗细胞凋亡的作用，通过抑制氧化应激和减少自由基的产生，保护细胞免受氧化应激引起的损伤。另外，GSPE还能够抑制炎症反应和免疫细胞的活化，从而减少细胞凋亡的发生。

本研究结果发现，与健康组比较，心肌梗死大鼠心肌组织中Bcl－2水平降低、Caspase－3水平升高，在经过GSPE干预后，Bcl－2水平有所升高、Caspase－3水平有所降低，且呈现出剂量依赖性。占天为等［10］研究表明在心肌梗死大鼠体内，Bcl－2水平降低，Caspase－3水平升高；张中喜等［11］研究表明，GSPE通过降低Caspase－3水平，提高Bcl－2的表达来抑制心肌细胞凋亡。心肌梗死发生后，心肌细胞凋亡导致心肌收缩功能异常，增加了心肌耗氧量，心室重构是导致心肌梗死产生的基础。心室重构产生后，心脏会从代偿期发展为心功能不全后心脏衰竭。LVESD、LVEDD可反映心室收缩功能，LVEF、LVFS是评价心功能的特异性指标［12］。有研究表明GSPE可保护心功能［13］。本研究中，心肌梗死大鼠较健康大鼠LVEDD、LVESD水平有所升高，LVEF、LVFS水平有所下降，在经过GSPE干预后表达相反，且以GSPE高剂量组效果更为显著，说明GSPE可改善心肌功能。GSPE具有强大的抗氧化活性，可以清除自由基，减轻氧化应激，保护心脏细胞免受氧化损伤，同时，GSPE能够促进血管舒张和增加一氧化氮（NO）的产生，改善血管功能，降低血压，发挥心脏功能保护作用。徐赟晟等［14］对心肌梗死大鼠研究显示，与健康大鼠比较，LVEDD、LVESD水平升高，LVEF、LVFS水平下降。Ruan等［15］对心肌梗死大鼠研究后提出，GSPE通过调节LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS表达保护心功能。本研究结果与相关文献研究结果相似。

AngⅡ、PRA、醛固酮是维持体内血压及体液平衡的重要指标。AngⅡ能够促进心脏纤维母细胞增殖和细胞外基质的产生，是心肌肥大的主要因素。AngⅡ可抑制基质金属蛋白酶的活性，而后者是降解心脏间质中胶原纤维的关键酶，除此之外，AngⅡ还可通过促进交感神经兴奋释放内皮素1，使血管阻力升高、诱导心肌细胞凋亡、促进心室重构。近年来，国外对GSPE的研究发现有心血管保护作用，自由基清除能力可抗心肌缺血再灌注损伤，通过抑制低密度脂蛋白的氧化作用而抗动脉粥样硬化，并具有降低血压、调节血脂等心血管方面的疾病［16］。在本研究中，心肌梗死大鼠体内Ang Ⅱ、PRA、醛固酮表达均有所升高，经过药物干预后水平下降；熊力等［17］实验后提出AngⅡ、PRA、醛固酮量正相关，在心肌梗死病人体内水平升高；张先杰［18］对高血压大鼠左心室重构的研究汇总提出，GSPE通过降低AngⅡ表达缓解心室重构。本研究与以上研究结果相似。GSPE通过降低AngⅡ水平，从而抑制PRA、醛固酮表达，进而达到保护心血管、修复心肌的作用。

心肌梗死后肾脏胶原合成与降解失衡，肾血流减少，肾脏纤维化与液体潴留产生，影响肾脏功能。AQP2 参与多种器官组织液体转运过程，可调节肾脏水重吸收作用。相关研究发现，AQP2在慢性心力衰竭病人体内水平增加，且其在水潴留过程中发挥着重要作用［19］。有研究表明，GSPE可改善高血压大鼠肾脏结构，保护肾功能［20］。本研究中，AQP2水平在心肌梗死大鼠中高于健康大鼠，经过GSPE治疗后水平有所下降。路琼琼等［21］对心力衰竭大鼠研究中发现，降低AngⅡ、AQP2水平可改善慢性心力衰竭病情，提示苓桂术甘汤联合肾气丸可通过降低AngⅡ表达抑制心脏纤维化，抑制AQP2水平进而抑制病人心肌梗死导致的肾脏损伤的进程；俞瑞群等［22］提出AQP2与心力衰竭的发生发展密切相关，严氏温阳化瘀利水方通过降低AQP2水平，减少心肌细胞凋亡、修复心肌损伤；王红珊等［23］心肌缺血再灌注大鼠的实验显示，GSPE通过降低AQP2水平，进而改善心功能，对心肌缺血再灌注起保护作用；管若兰［24］运用大鼠建立急性肾损伤模型，给予GSPE干预后发现，大鼠肾损害伤有所改善，提示GSPE治療可干预肾损伤。本研究结果也支持上述研究成果。

综上所述，GSPE对心肌梗死具有保护作用，可改善心功能水平，减少心肌细胞凋亡，其作用机制可能与调控AQP2蛋白表达有关。

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（收稿日期：2022－03－14）

（本文编辑王雅洁）

基金项目 河北省医学科学研究课题计划项目（No.20210854）；河北省邯郸市研发投入引导计划项目（No.19422083012）

引用信息 郭华，武报佳，邢慧敏，等.葡萄籽原花青素提取物对心肌梗死大鼠肾素－血管紧张素系统及AQP2蛋白表达的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（1）：62－67.