Wnt/β－catenin信号通路在七氟醚诱导术后认知障碍中的作用机制

常鑫　杨文曲　韩冲芳　赵雪丽　陈焱

摘要 目的：探讨通过激活Wnt/β－catenin信号通路抑制炎症反应对七氟醚诱导的老年大鼠术后认知障碍（POCD）的影响。方法：将60只雄性大鼠随机分为对照组（C组）、3%七氟醚组（S组）、氯化锂（LiCl）＋3%七氟醚组（LiCl＋S组），每组20只。S组、LiCl＋S组吸入3%七氟醚6 h，C组吸入空氧混合气体6 h，LiCl＋S组于吸入七氟醚前连续5 d腹腔注射LiCl 2 mmol/kg，每日1次。七氟醚麻醉结束后24 h，随机取每组10只大鼠，采用Morris水迷宫实验检测老年大鼠认知功能，前4 d进行定位航行实验，第5天进行空间探索实验。水迷宫实验结束后立即处死大鼠，采用苏木精－伊红（HE）染色法观察海马组织病理形态学改变。七氟醚麻醉结束后24 h，取每组剩余10只大鼠立即处死，采用蛋白免疫印迹法（Western Blot）法检测海马区肿瘤坏死因子－α（TNF－α）、白细胞介素－1（IL－1）、β－catenin及磷酸化糖原合酶激酶 3β（p－GSK－3β）蛋白表达水平。结果：与C组相比，S组和LiCl＋S组水迷宫实验第2天、第3天、第4天逃避潜伏期明显延长（P＜0.05），第5天平台所在象限停留时间明显缩短（P＜0.05），穿越平台次数明显减少（P＜0.05），海马组织出现病理形态学损伤，海马区TNF－α及IL－1蛋白表达水平升高（P＜0.05），S组海马区β－catenin及p－GSK－3β蛋白表达水平降低（P＜0.05），LiCl＋S组海马区β－catenin及p－GSK－3β蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与S组相比，LiCl＋S组水迷宫第2天、第3天、第4天的逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05），第5天平台所在象限停留时间明显延长（P＜0.05），穿越平台次数明显增多（P＜0.05），海马组织病理形态学损伤现象有所改善，海马区TNF－α及IL－1蛋白表达水平明显下降（P＜0.05），β－catenin及p－GSK－3β蛋白表达水平升高（P＜0.05）。结论：LiCl通过激活Wnt/β－catenin信号通路抑制炎症反应改善七氟醚诱导的术后认知障碍。

关键词 认知障碍；Wnt/β－catenin信号通路；七氟醚；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.01.013

术后认知障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是一种多发于老年人的术后并发症，表现为认知能力下降、精神错乱和人格改变等，其发生影响病人的健康，给病人家庭和社会造成了极大的负担。因此，预防POCD的发生以及促进认知功能的恢复具有重要意义［1］。七氟醚是临床上广泛应用的吸入麻醉药，研究表明，七氟醚可以诱导老年大鼠发生认知功能损伤，并且与激活的炎症反应有关［2］。Wnt信号通路参与对海马记忆功能的调控，包括Wnt3a、糖原合酶激酶 3β（GSK－3β）、β－catenin等，其中GSK－3β是該信号通路的负调节剂，氯化锂（LiCl）是该通路的激活剂［3］。研究证实，Wnt/β－catenin信号通路通过抑制核转录因子κB（NF－κB）通路减少炎性因子的转录，起到抗炎的作用［4］。另外，七氟醚在诱导术后认知障碍过程中表现出与神经系统退行性疾病阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）相似的病理改变，而在AD中，LiCl通过激活Wnt/β－catenin信号通路可以减轻炎症反应和海马神经元的损伤，起到神经保护的作用［5］。但在七氟醚诱导的POCD中，LiCl是否通过激活Wnt信号通路调控炎症反应发挥作用尚无相关报道。本研究拟探讨LiCl通过激活Wnt信号通路调控炎症反应在七氟醚诱导POCD中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

60只300～350 g雄性SD大鼠（鼠龄19～22个月）由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供。实验前在暗室［温度（23±3）℃，相对湿度40%～70%］分笼饲养1周，并给予充足的水与食物。实验前禁食12 h，自由饮水。将大鼠随机分为对照组（C组）、3%七氟醚组（S组）、LiCl＋3%七氟醚组（LiCl＋S组），每组20只。参考相关文献［6］的方法，S组、LiCl＋S组吸入3%七氟醚6 h，C组吸入空氧混合气体6 h。LiCl＋S组于吸入七氟醚前连续5 d腹腔注射LiCl（120M0215V，Sigma公司）2 mmol/kg，每日1次。

1.2 Morris水迷宫实验

每组随机取10只大鼠在麻醉结束后24 h行Morris水迷宫实验，前4 d进行定位航行实验，第5天进行空间探索实验。前4 d将大鼠依次从不同象限面向池壁放入水中，记录大鼠从入水到爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期，停留30 s后进行下一象限的实验。将60 s内未找到平台的逃避潜伏期记为60 s，由实验者将其引上平台并停留30 s。第5天进行空间探索实验，将水中平台撤除，并将大鼠从任一象限放入水中。记录其在60 s内的游泳速度、穿越平台次数和平台所在象限停留时间。

1.3 苏木精－伊红（HE）染色

水迷宫实验结束后，在冰上取出大鼠脑组织，经生理盐水冲洗后在4%多聚甲醛中固定，然后进行脱水，石蜡包埋，切片。将石蜡切片进行HE染色，中性树脂封片，然后在显微镜下观察。

1.4 蛋白免疫印迹法（Western  Blot）检测

每组取剩余10只大鼠在麻醉后的24 h立即处死，取出海马组织，提取目标蛋白，采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）方法，将准备好的样品液和预染蛋白Marker分别上样，电泳分离蛋白。转膜结束后在5%脱脂奶粉溶液中室温封闭1 h。加入肿瘤坏死因子－α（TNF－α）、白细胞介素－1（IL－1）、β－catenin、磷酸化GSK－3β（p－GSK－3β）及甘油醛－3－磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗（1∶1 000，武汉爱博泰克生物科技有限公司）4 ℃过夜，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000，武汉爱博泰克生物科技有限公司），室温孵育1 h。化学发光法对条带显影后，采用Image J软件检测海马区TNF－α、IL－1、β－catenin及p－GSK－3β蛋白相对表达水平。

1.5 统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行统计分析。符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间差异的采用LSD法进行两两比较，重复测量资料采用重复测量方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠认知功能比较

3组大鼠水迷宫实验第1天逃避潜伏期比较差异无统计学意义（P＞0.05），第2天、第3天、第4天逃避潜伏期逐渐缩短。与C组比较，S组和LiCl＋S组水迷宫实验第2天、第3天、第4天逃避潜伏期明显延长，第5天平台所在象限停留时间明显缩短，穿越平台次数明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与S组比较，LiCl＋S组水迷宫实验第2天、第3天、第4天的逃避潜伏期明显缩短，第5天平台所在象限停留时间明显延长，穿越平台次数明显增多，差异均有统计学意义（P＜0.05）。3组大鼠水迷宫实验期间游泳速度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表1、表2。

2.2 3组大鼠海马组织病理形态学比较

C组大鼠海马组织神经元细胞形态正常，细胞排列整齐规则。与C组比较，S组海马组织神经元细胞分布不均匀，排列紊乱，出现大量核固缩。与S组比较，LiCl＋S组海马组织神经元细胞排列紊乱现象有所改善，出现核固缩的细胞减少。详见图1。

2.3 3组大鼠海马区TNF－α、IL－1、β－catenin及p－GSK－3β蛋白表达水平比较

与C组比较，S组海马区TNF－α及IL－1蛋白表达水平升高（P＜0.05），β－catenin及p－GSK－3β蛋白表达水平降低（P＜0.05）；LiCl＋S组海马区TNF－α及IL－1蛋白表达水平升高（P＜0.05），β－catenin及p－GSK－3β蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与S组比较，LiCl＋S组海马区TNF－α及IL－1蛋白表達水平降低（P＜0.05），β－catenin及p－GSK－3β蛋白表达水平升高（P＜0.05）。详见表3、图2。

3 讨 论

七氟醚可以诱导POCD的发生，导致空间学习能力和记忆能力的下降［7］。以往研究表明，当吸入高于3%浓度的七氟醚6 h后，老年大鼠认知功能发生明显损伤［8］。因此，本实验选择吸入3%七氟醚6 h。与C组相比，S组大鼠在七氟醚麻醉后的逃避潜伏期明显延长，平台所在象限停留时间明显缩短，穿越平台次数明显减少。说明七氟醚麻醉后大鼠出现了认知能力的下降，模型制作成功。

麻醉后机体释放的大量细胞信号分子结合相应受体而触发炎症反应，包括TNF－α、IL－1、IL－6等［9］。海马区TNF－α、IL－6等炎性因子的异常表达介导细胞凋亡，参与POCD的发生［10］。七氟醚通过促进炎症反应以及神经细胞的凋亡导致POCD的发生［11］。临床研究发现，吸入七氟醚超过3 h可以促进POCD的发生，并且与血清TNF－α的表达水平有关［12］。动物实验发现，在七氟醚诱导的老年大鼠POCD模型中，海马组织神经细胞发生了明显损伤［8］。本研究结果显示，老年大鼠吸入3%七氟醚6 h后认知能力下降，海马区中TNF－α及IL－1表达水平明显升高，同时光学显微镜下海马组织神经元细胞分布不均匀，排列紊乱。证实了七氟醚诱导的POCD与激活的炎症反应有关，与以往的研究结果相符。

Wnt/β－catenin通路的激活可抑制炎症反应的发生，一方面，Wnt共受体LRP5包含一种抗炎巨噬细胞表型，可以减少单核细胞向巨噬细胞分化［13］；另一方面，Wnt/β－catenin通过磷酸化GSK－3β抑制核因子－κB（NF－κB）信号通路，从而减少促炎基因的转录［14］。研究证实，Wnt/β－catenin通路参与了POCD的发生［15］，在内皮细胞中，吸入3%七氟醚6 h可以抑制Wnt/β－catenin通路，从而下调Annexin A1的表达，引起血脑屏障的损伤，导致POCD的发生［16］。转基因小鼠中，DKK－1的过表达可通过抑制Wnt/β－catenin通路，引起Tau蛋白过度磷酸化和认知功能障碍［17］。在本研究中，LiCl＋S组大鼠吸入3%七氟醚6 h后，海马区β－catenin及p－GSK－3β表达水平下降，TNF－α及IL－1表达水平升高，同时海马形态学结构发生损伤。提示七氟醚麻醉后海马区GSK－3β活性升高，抑制Wnt/β－catenin信号通路活性，从而炎症反应被激活。LiCl是Wnt/β－catenin通路的激活剂，可以调节GSK－3β的活性［18］，给予LiCl干预后，与S组比较，老年大鼠海马区β－catenin及p－GSK－3β表达水平升高，TNF－α及IL－1表达水平明显下降，同时海马形态学结构损伤减轻，学习和记忆能力有所改善。表明Wnt/β－catenin通路参与了七氟醚诱导POCD的发生，LiCl通过激活Wnt/β－catenin通路，减少炎性因子的表达和减轻海马组织的损伤，改善老年大鼠的术后认知功能。

综上所述，七氟醚通过抑制Wnt/β－catenin通路，激活炎症反应，导致海马组织损伤和POCD的发生。外源性Wnt/β－catenin激活剂LiCl可以明显上调Wnt/β－catenin通路，抑制炎症反应，减轻海马组织病理形态学损伤，改善认知功能。

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（收稿日期：2022－01－08）

（本文编辑郭怀印）

通讯作者 韩冲芳，E－mail：hanchongfang2003@foxmail.com

引用信息 常鑫，杨文曲，韩冲芳，等.Wnt/β－catenin信号通路在七氟醚诱导术后认知障碍中的作用机制［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（1）：75－78.