苦豆碱通过调控miR－210对脂多糖致心肌细胞凋亡及炎性因子表达的影响

初毅　代宁　曹艳杰

摘要 目的：探讨苦豆碱对脂多糖（LPS）致心肌细胞凋亡和炎症反应的影响。方法：将大鼠心肌H9c2细胞分为NC组（不作任何处理）、LPS组、LPS＋苦豆碱低剂量组、LPS＋苦豆碱中剂量组、LPS＋苦豆碱高剂量组、LPS＋miR－NC组、LPS＋miR－210组、LPS＋苦豆碱中剂量组＋anti－miR－NC组、LPS＋苦豆堿中剂量组＋anti－miR－210组。通过细胞计数试剂盒－8（CCK－8）、流式细胞术、蛋白免疫印迹法检测细胞增殖、凋亡及其相关蛋白表达情况；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白细胞介素－1β（IL－1β）、肿瘤坏死因子－α（TNF－α）水平；实时荧光定量聚合酶链式反应（RT－PCR）检测miR－210表达水平。结果：不同浓度苦豆碱处理后，LPS处理的心肌细胞活性及Ki－67、Bcl－2、miR－210蛋白表达水平增加，细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达水平降低，IL－1β、TNF－α水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。过表达miR－210后LPS处理的心肌细胞活性、Ki－67、Bcl－2表达水平增加，细胞凋亡率及p21、Bax表达水平降低，IL－1β、TNF－α水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。干扰miR－210表达能逆转苦豆碱对LPS诱导的H9c2细胞增殖、凋亡及炎性因子的影响。结论：苦豆碱可通过上调miR－210抑制LPS致心肌细胞凋亡和炎症反应。

关键词 苦豆碱；miR－210；脂多糖；心肌细胞凋亡；炎性因子；白细胞介素－1β；肿瘤坏死因子－α；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.01.009

心血管疾病为临床高发病，严重威胁着人民的身体健康，常见的心血管疾病有心律失常、心肌缺血、心肌梗死等，近年来中医药在治疗心血管疾病方面表现出独特优势，疗效确切，安全性较好［1］。心肌损伤与心血管疾病的发生发展密切相关，而细胞凋亡与炎症反应在心肌损伤的发生中起重要作用［2－3］。苦豆碱是从豆科植物苦豆草的种子及地上部分提取的一种生物碱，具有抗菌、抗炎、抗心律失常和心肌保护等作用［4］。苦豆碱可通过抑制炎症反应改善异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚［5］。苦豆碱可通过激活磷脂酰肌醇3－激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路抗心肌细胞缺血再灌注引起的损伤及炎症应答［6］；对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压具有保护作用［7］；可抑制氧化型低密度脂蛋白（ox－LDL）诱导的人脐静脉血管内皮细胞的内皮功能障碍和炎症反应［8］。以上研究均表明苦豆碱具有抗损伤及抗炎作用。但苦豆碱对脂多糖（LPS）诱导的心肌细胞凋亡和炎症反应的影响及机制尚不清楚。miR－210是相关miRNA的一种，对心肌细胞凋亡和改善心脏功能具有重要作用；miR－210有望成为预测或诊断心血管疾病的标志物［9］。miR－210抑制过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡和自噬［10］，miR－210过表达可通过促进心肌细胞增殖和血管生成，促进心肌梗死后的心脏修复［11］。因此，本研究旨在探讨苦豆碱是否通过调控miR－210影响LPS诱导的心肌细胞损伤。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大鼠心肌H9c2细胞购于美国ATCC；LPS购于北京百奥莱博科技有限公司；DMEM购于美国Gibco公司；苦豆碱购于上海源叶生物科技有限公司；细胞计数试剂盒－8（CCK－8）试剂盒、凋亡试剂盒购于日本同仁化学研究所；二喹啉甲酸（BCA）试剂盒购于美国Pierce公司；荧光定量试剂盒购于上海经科化学公司；白细胞介素－1β（IL－1β）、肿瘤坏死因子－α（TNF－α）的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购于南京森贝伽生物公司。

1.2 细胞处理与分组

H9c2细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，取生长状态良好的H9c2细胞，将其随机分为NC组（不做任何处理）、LPS组（加入0.5 μg/mL的LPS）、LPS＋苦豆碱低剂量组（加入0.5 μg/mL的LPS和20 mg/L苦豆碱）、LPS＋苦豆碱中剂量组（加入0.5 μg/mL的LPS和50 mg/L苦豆碱）、LPS＋苦豆碱高剂量组（加入0.5 μg/mL的LPS和100 mg/L苦豆碱）、LPS＋miR－NC组（转染miR－NC＋0.5 μg/mL的LPS）、LPS＋miR－210组（转染miR－210＋0.5 μg/mL的LPS）、LPS＋苦豆碱中剂量组＋anti－miR－NC组（转染anti－miR－NC＋0.5 μg/mL的LPS＋和50 mg/L苦豆碱）、LPS＋苦豆碱中剂量组＋anti－miR－210组（转染anti－miR－210＋0.5 μg/mL的LPS＋和50 mg/L苦豆碱）。miR－NC、miR－210、anti－miR－NC、anti－miR－210转染的具体步骤：取50 μL无血清培养基稀释miR－NC、miR－210、anti－miR－NC、anti－miR－210的质粒，混匀；同时取50 μL无血清培养基稀释转染试剂，混匀后室温静置5 min，将上述两种溶液混合，室温静置20 min，然后将其与培养至80%融合度的细胞混合，转染6 h后进行药物处理。

1.3 CCK－8检测细胞增殖

取培养48 h的细胞，加10 μL的CCK－8试剂，孵育2 h后，酶标仪检测450 nm波长处OD值。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

取各组培养48 h的细胞，预冷后用磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗，加入V－异硫氰酸荧光素（Annexin V－FITC）10 μL，再加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）5 μL，避光孵育10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测相关蛋白表达

提取总蛋白，BCA试剂盒定量；行电泳后聚偏二氟乙烯（PVDF）转膜，接着封闭在5%脱脂奶粉中，加一抗4 ℃孵育过夜；加二抗室温孵育90 min，增强化学发光试剂（enhanced chemiluminescence，ECL）发光液显影，成像后检测蛋白条带灰度值，蛋白相对表达水平等于目的条带和β－actin条带灰度值的比值。

1.6 ELISA检测IL－1β、TNF－α水平

各组细胞培养48 h，按照IL－1β、TNF－α试剂盒说明操作，酶标仪检测450 nm波长处OD值，根据标准曲线计算上清液中IL－1β、TNF－α水平。

1.7 实时荧光定量聚合酶链式反应（RT－qPCR）检测miR－210表达水平

提取各组H9c2细胞总RNA，反转录成cDNA，进行RT－qPCR，以U6为内参，相对表达量用2－△△Ct法计算。miR－210正向引物：5′－ATGCCTGTGCGTGTGA－3′，反向引物：5′－GTGCGTGTCGTGGAGTC－3′。

1.8 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度苦豆碱对LPS诱导H9c2细胞增殖、凋亡的影响

与NC组比较，LPS组细胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表达水平降低，细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与LPS组比较，不同浓度苦豆碱组细胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表达水平升高，细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见图1、表1、图2。

2.2 不同浓度苦豆碱对LPS诱导H9c2细胞炎性因子的影响

与NC组比较，LPS组IL－1β、TNF－α水平升高（P＜0.05）；与LPS组比较，不同浓度苦豆碱组IL－1β、TNF－α水平降低（P＜0.05）。详见表2。

2.3 不同浓度苦豆碱对LPS诱导H9c2细胞miR－210表达的影响

与NC组比较，LPS组H9c2细胞中miR－210表达水平降低（P＜0.05）；与LPS组比较，不同浓度苦豆碱组H9c2细胞中miR－210表达水平升高（P＜0.05）。詳见表3。

2.4 过表达miR－210对LPS诱导H9c2细胞增殖和凋亡的影响

与LPS＋miR－NC组比较，LPS＋miR－210组miR－210表达水平、细胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表达水平升高，细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.001）。详见表4、图3、图4。

2.5 过表达miR－210对LPS诱导H9c2细胞炎性因子的影响

与LPS＋miR－NC组比较，LPS＋miR－210组IL－1β、TNF－α水平降低（P＜0.001）。详见表5。

2.6 干扰miR－210表达能逆转苦豆碱对LPS诱导H9c2细胞增殖、凋亡及炎性因子的影响

与LPS＋苦豆碱中剂量＋anti－miR－NC组比较，LPS＋苦豆碱中剂量＋anti－miR－210组miR－210表达水平、细胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表达水平降低，细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达水平升高，IL－1β、TNF－α水平升高（P＜0.05）。详见图5、图6、表6。

3 讨 论心肌细胞凋亡与多种心血管疾病有关，而许多心血管疾病都伴随着炎症反应的发生，抑制心肌细胞凋亡和炎症反应对防治心血管疾病具有重要意义。最近的研究显示，中医药治疗可抑制心肌细胞凋亡和炎症反应［12－13］。有研究报道，苦豆碱对海马神经元氧糖剥夺再灌注损伤具有明显的保护作用［14］。苦豆碱可抑制心肌细胞凋亡，从而减轻冠状动脉微栓塞引起的心肌损伤［15］；可通过调控核转录因子－κB（NF－κB）信号通路，降低炎性因子TNF－α及IL－1β水平，从而改善哮喘小鼠肺功能，减轻哮喘症状及炎症反应［16］；可通过抑制炎症反应来抑制人肺血管平滑肌细胞增殖［17］。本研究发现，不同浓度苦豆碱处理LPS诱导的心肌细胞后，心肌细胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表达升高，细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达水平降低，IL－1β、TNF－α水平降低，提示苦豆碱可减轻LPS诱导的心肌细胞损伤。

研究报道，miR－210可以抑制氧葡萄糖剥夺/再灌注诱导的心肌细胞凋亡［18］。miR－210可减轻心肌梗死后心脏细胞凋亡［19］。本研究结果显示，不同浓度苦豆碱处理LPS诱导的心肌细胞中，增加miR－210表达水平；过表达miR－210增加LPS处理的心肌细胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表达水平，降低细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达水平，降低IL－1β、TNF－α水平。表明过表达miR－210抑制了LPS诱导的心肌细胞凋亡和炎症反应，与以往研究结果相符，miR－210具有抑制心肌细胞凋亡的作用。还有研究报道miR－210具有抗炎作用，如miR－210－3p可通过抑制胰岛素样生长因子2（IGF2）减轻动脉粥样硬化中的炎症反应［20］。紫草素可能通过上调miR－210减轻LPS诱导的人肾小管上皮细胞（HK－2）炎性损伤［21］。此外，本研究结果显示，干扰miR－210表达逆转苦豆碱对LPS诱导的H9c2细胞增殖、凋亡及炎性因子的影响。综上所述，苦豆碱可通过增加miR－210抑制LPS致心肌细胞凋亡和炎症反应。

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（收稿日期：2022－09－23）

（本文编辑郭怀印）

引用信息 初毅，代宁，曹艳杰.苦豆碱通过调控miR－210对脂多糖致心肌细胞凋亡及炎性因子表达的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（1）：51－55.