高效液相色谱- 串联质谱法测定动物源性食品中马波沙星的残留

陈 灵，栾庆祥，黄 鑫，金晓峰，赵 贵

（贵州省兽药饲料检测所，贵州贵阳 550003）

0 引言

马波沙星（Marbofloxacin，MBF） 属于氟喹诺酮类抗菌药物，通过抑制细菌DNA 回旋酶活性，阻止其DNA 的合成复制，进而发挥抗菌作用，对革兰阴性菌、革兰阳性菌和支原体表现出良好的抗菌效果[1-3]。马波沙星给药后吸收迅速完全，体内分布广泛，生物利用度高，作用于体内多个组织[4-7]；常用于牛的呼吸道感染和急性乳房炎，猪的无乳综合症，以及犬猫的感染性疾病[8-13]。

目前，针对马波沙星的检测方法主要涉及酶联免疫法[14-15]、胶体金免疫层析[16]、表面增强拉曼光谱（Surface Enhanced Raman Scattering，SERS）[17]、荧光探针法[18]、液相色谱法[19-21]、高效液相色谱- 串联质谱法[22-23]。其中，液相色谱- 串联质谱法具有灵敏度高、选择性强等特点，对马波沙星的残留分析具有较大的优势。在马波沙星的已有检测标准[24-25]中，也使用了液相色谱- 串联质谱法，但方法的前处理过程较为繁琐，各方法能检测的样品种类少，不能较好地满足多种类样品的快速准确检测。鉴于马波沙星常被应用于多种动物的疾病治疗，在动物体内分布于多个靶组织中，需要一种能涵盖多种动物组织的检测方法。因此，建立了一种简便快捷、高效灵敏且能满足多种动物组织中马波沙星检测的HPLC-MS/MS 方法，为保证动物性食品的质量安全和马波沙星的后续检测标准研究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

（1） 仪器。AB Sciex Triple 6500+三重四极杆液质联用仪，上海SCIEX 分析仪器贸易有限公司产品；全自动智能氮吹仪、多样品旋涡混合器，广州得泰公司产品；ACQUITY HSS T3 型色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），美国沃特世公司产品；3K15 型高速冷冻离心机，德国Sigma 公司产品；KQ-500 DE产品数控超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司产品；0.22 μm wwPTFE 微孔滤膜，美国PALL 公司产品；Milli-Q Direct-Q10 产品超纯水机，美国默克密理博公司产品。

（2） 试剂。乙腈（色谱级），美国默克公司提供；甲醇（质谱级），美国Fisher 公司提供；甲酸（质谱级），上海安谱实验科技股份有限公司提供；乙酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司提供；正己烷（分析纯），国药集团化学试剂有限公司提供；试验用超纯水为Milli-Q Direct-Q10 超纯水机制备。

马波沙星-D8标准品（纯度96%），加拿大Toronto Research Chemicals 公司提供；马波沙星标准品（纯度99.8%），中国兽医药品监察所提供。

试验用的牛肉、牛肝、牛肾、牛脂肪、牛奶、猪肉、猪肝、猪肾、猪脂肪等9 种样品，均购自当地市场。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

（1） 标准储备液。准确称取马波沙星标准品10 mg，用乙腈溶解并稀释至10 mL 容量瓶中，配制成质量浓度为1 mg/mL 的马波沙星标准贮备液，0 ℃以下避光保存；准确称取马波沙星-D8标准品0.5 mg，用乙腈溶解并稀释至10 mL 容量瓶中，得50 μg/mL 马波沙星-D8标准贮备液，0 ℃以下避光保存。

（2） 标准中间液。准确量取马波沙星标准储备液0.1 mL，于100 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成质量浓度为1 μg/mL 的马波沙星标准中间液；准确量取马波沙星-D8标准储备液0.1 mL，于5 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成质量浓度为1 μg/mL 的马波沙星-D8标准中间液。

（3） 标准曲线工作溶液。准确量取马波沙星中间液和马波沙星-D8标准中间液适量，用0.1%甲酸水+甲醇（9+1） 配制成马波沙星质量浓度为5，20，50，100，200，400 μg/L，马波沙星-D8质量浓度均为10 μg/L 的马波沙星系列标准工作溶液。

1.2.2 样品的前处理

牛肉、牛肝、牛肾、牛脂肪、猪肉、猪肝、猪肾和猪脂肪均捣碎均质后使用，牛奶直接使用。

（1） 样品提取。称取试料2 g（准确至0.02 g），置于50 mL 离心管中，加入1 μg/mL 的马波沙星-D8标准中间液20 μL，加入8 mL 的1%乙酸乙腈溶液，涡旋0.5 min，超声振荡10 min，于低温5 ℃下以转速10 000 r/min 离心5 min，取上清液转入到另一10 mL 离心管中，于50 ℃下氮气吹干，准确加入2 mL 的0.1%甲酸水+甲醇（9+1） 复溶，待净化。

（2） 样品净化。于复溶液中加入正己烷4 mL，涡旋1 min，于低温5 ℃下以转速10 000 r/min 离心5 min，取下层溶液过0.2 μm 有机滤膜，供高效液相色谱- 串联质谱仪测定。

1.2.3 色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量1 μL，流动相A 为0.1 %甲酸水，B 为乙腈，梯度洗脱0～0.5 min，95%A；0.5～6.5 min，95%～80%A；6.5～7.0 min，80%～10%A；7.0～7.1 mim，10%～95%A；7.1～9.0 min，95%A。

1.2.4 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）：正离子扫描；扫描方式为多反应监测（MRM），喷雾电压5.5 kV，气帘气40 psi，喷雾气45 psi，辅助气40 psi，离子源温度500 ℃。

马波沙星和马波沙星-D8的MRM参数见表1。

表1 马波沙星和马波沙星-D8 的MRM 参数

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 质谱条件的确定

马波沙星属于氟喹诺酮类药物，分子结构含有多个N 原子而显一定的弱碱性，因此选择正离子模式电离。分别取质量浓度1 μg/mL 的马波沙星和1 μg/mL 的马波沙星-D8溶液进行全扫描，得到相应的准分子离子分，确定母离子。调整电离电压和离子源温度使母离子响应值最佳，最终确定电离电压为5.5 kV，离子源温度为500 ℃。对母离子进行子离子全扫描，确定定量离子对和定性离子对，并优化去簇电压和碰撞能量，确定最佳参数。

2.1.2 色谱条件的确定

马波沙星极性弱，具有良好的脂溶性，在反相C18色谱柱上具有良好的保留，选择具有高分离能力、高耐压性和pH 值适用范围广的Waters ACQUITY HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 色谱柱，试验发现在该色谱柱条件下，目标化合物分离效果好、峰型尖锐对称。试验比较了水- 甲醇、水- 乙腈、0.1%甲酸水- 甲醇和0.1%甲酸水- 乙腈4 种流动相体系下的色谱峰形及响应值，发现用0.1%甲酸水- 乙腈作流动相时，目标化合物具有良好的响应，保留稳定、峰型好，柱压也较低，因此确定0.1%甲酸水- 乙腈为流动相。在此条件下，马波沙星MRM总离子流色谱图。

马波沙星的总离子流色谱图见图1。

图1 马波沙星的总离子流色谱图

2.2 提取溶剂的选择

动物肌肉、内脏、脂肪和生鲜乳中含量较高的蛋白质和脂肪，对目标物的提取和后续的检测有较大的干扰，提取溶剂应能最大限度地减少此类物质的提出。在常用的提取溶剂中，因马波沙星在乙腈中具有良好的溶解性，且乙腈具有一定的蛋白沉淀作用，高速离心后可去除一定量的蛋白，同时乙腈能减少对脂肪的提取，因此选择乙腈作为提取溶剂，能获较好的回收率。由于马波沙星的分子结构中含有多个N 原子，具有弱碱性，加入适量的乙酸使其离子化，增加极性，有利于提高马波沙星在乙腈中的溶解度，试验发现使用1%的乙酸乙腈提取时，在有效去除干扰杂质的同时能获得良好的回收率。最终确定1%的乙酸乙腈作为提取溶剂。

2.3 净化方式的选择

试验比较了3 种净化方式：一是样品经1%乙酸乙腈提取、氮气吹干、0.1%甲酸水+甲醇（9+1） 复溶处理后，复溶液过0.22 μm 有机滤膜后直接上机测定；二是样品经1%乙酸乙腈提取后，加入适量正己烷除脂，氮气吹干，0.1%甲酸水+甲醇（9+1） 复溶后过0.22 μm 有机滤膜；三是样品经1%乙酸乙腈提取、氮气吹干、0.1%甲酸水+甲醇（9+1） 复溶后，复溶液经正己烷脱脂，取下层溶液过0.22 μm滤膜后上机测定。试验发现，方法一未能有效地达到净化的目的，得到的色谱图杂峰较多、干扰大，较多的杂质还可能对仪器造成污染及损害；方法二和方法三得到的色谱图基本一致，杂峰少、干扰小，但方法二需要消耗更多量的正己烷，综合考虑净化效果、经济实用等因素，最终确定复溶后再脱脂的净化方式。

2.4 复溶液的选择

分别考查了乙腈：0.1%甲酸水（20∶80，V∶V）、乙腈：0.1%甲酸水（10∶90，V∶V）、甲醇：0.1%甲酸（20∶80，V∶V）、甲醇：0.1%甲酸水（10∶90，V∶V） 等4 种溶剂作为样品氮气吹干后的复溶液，对目标物的响应值和峰型的影响。试验发现，当复溶液中有机相为乙腈时，虽然色谱峰峰型较好，但背景干扰比有机相为甲醇的复溶液时的背景干扰高；而当有机相为甲醇时，过高甲醇浓度会抑制目标物的响应。因此，最终确定样品复溶液为甲醇：0.1%甲酸水（10∶90，V∶V）。

2.5 方法学的验证

2.5.1 线性范围和定量限、检出限

取“1.3.1”制备的马波沙星质量浓度为5，20，50，100，200，400 μg/L，马波沙星-D8质量浓度均为10 g/L 的马波沙星系列标准工作溶液，供液相色谱- 串联质谱测定，以马波沙星与马波沙星-D8的峰面积比值为纵坐标（Y），马波沙星的质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。结果表明，在5.0～400.0 ng/mL 的浓度范围内，马波沙星呈现良好的线性关系，回归方程为Y=0.235 67X-0.286 85，相关系数（R） 为0.999 6。在各基质中添加适量的标准溶液，以信噪比S/N＞3，确定检出限（Limit of Detection，LOD） 为1.5 μg/kg；以信噪比S/N＞10，确定量限（Limit of quantitation，LOQ） 为5.0 μg/kg。

2.5.2 准确度和精密度

采用添加回收的方法考查该方法的准确度和精密度。根据相关标准对兽药残留检测方法精密度和准确度的规定[26]，分别在猪肌肉、肝脏、肾脏和脂肪，以及牛肌肉、脂肪、肝脏、肾脏和牛奶的空白基质中添加适量马波沙星标准溶液，每种空白基质添加4 个质量浓度水平，每个质量浓度进行3 批试验，每批5 个平行样品，按“1.3”的试验方法进行前处理测定，分别计算每批单独试验的批内平均回收率、相对标准偏差（RSD） 和全部批次的批间平均回收率、相对标准偏差（RSD）。

马波沙星的回收率和相对标准偏差见表2。

由表2 可知，肌肉、肝脏、肾脏添加质量浓度为5.0～300.0 μg/kg 时、脂肪添加质量浓度为5.0～100.0 μg/kg 时、牛奶添加质量浓度为5.0～150.0 μg/kg时，马波沙星的平均回收率为82.6%～108.6%，相对标准偏差为0.45%～6.86%，该方法具有良好的准确度和精密度。

2.6 实际样品测定

使用该方法对市场采购的牛肉、牛肝、牛肾、牛脂肪、牛奶、猪肉、猪肝、猪肾、猪脂肪等各10 批样品进行检测，均未检出马波沙星。

3 结论

建立了一种能同时满足牛肉、牛肝、牛肾、牛脂肪、牛奶、猪肉、猪肝、猪肾和猪脂肪等9 种动物基质中马波沙星残留检测的高效液相色谱- 串联质谱法。该方法前处理简单、灵敏度高、重现性好、涵盖多种动物组织，适用于动物源性食品中马波沙星残留的快速检测。