乙醇萃取对大豆分离蛋白风味影响研究

李晓敏，季国志，董 阳

（内蒙古蒙牛乳业（集团） 股份有限公司，内蒙古呼和浩特 011500）

近年来，随着植物基产品的迅速发展，植物蛋白的开发和应用备受关注。大豆分离蛋白（Soybean protein isolate，SPI） 因蛋白质消化利用率高，富含人体必需氨基酸及独特的功能特性[1]，成为食品加工重要的植物蛋白原料。由于其原料大豆在加工过程中产生较多挥发性风味物质[2-4]，极大地限制了大豆分离蛋白的广泛应用。这些挥发性风味物质大致可分为非豆腥味物质和豆腥味物质。非豆腥味物质是大豆本身含有的具有愉悦气味的风味成分，如苯甲醛等，但在一些植物基替代产品中应用时，这些风味也常常被去除或被掩盖[5]。豆腥味物质主要是大豆分离蛋白在加工或贮藏过程脂肪氧化酶（Lip-oxygenase，LOX） 氧化不饱和脂肪酸或者由光敏自动氧化产生的[6]，多数为一些醛、酮和醇类化合物，如己醛、戊醛、1 - 辛烯- 3 - 醇、2 - 戊基呋喃、2,4 -癸二烯醛等，能使产品产生豆腥、油脂、青草等不良风味[2，7]。豆腥味的去除是食品行业比较关注和需重点解决的技术问题。目前，大豆分离蛋白工业生产多采用传统的碱溶酸沉工艺，随着大豆加工迁移带入的特征风味仍比较明显[8]。溶剂萃取法是通过搅拌、混合或离心将风味化合物从食品基质中转移到有机溶剂中，以达到分离风味成分的目的[8]。乙醇是常用的有机溶剂，可以通过萃取除去大豆分离蛋白中的醛、醇类等化合物，改善产品风味[9]。采用乙醇处理大豆分离蛋白，通过顶空固相微萃取和气相色谱- 质谱联用（GC-MS） 技术分析萃取前后大豆分离蛋白中主要挥发性风味物质变化，并结合感官评价综合分析采用乙醇处理大豆分离蛋白制备豆奶的风味改善情况，综合探讨乙醇萃取对大豆分离蛋白风味的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白，杜邦双汇漯河食品有限公司提供；乙醇（≥95%），内蒙古利牛生物化工有限责任公司提供；椰子油，秦皇岛金海特种食用油工业有限公司提供；白砂糖，中粮屯河崇左糖业有限公司提供；磷脂，嘉吉亚太食品系统（北京） 有限公司提供。

1.2 仪器与设备

CR21GII 型高速冷冻离心机，日本日立集团产品；STRIKE 280 型旋转蒸发仪，德国Chemtron 公司产品；TQ8030 型气质联用仪，日本岛津公司产品；57348-U 型固相微萃取头，美国Supelco 公司产品；ME5002TE 型电子天平，美国梅特勒托利多有限公司产品；RET control-visc 型磁力搅拌器，德国IKA 公司产品；W20M-2 型恒温水浴箱，美国SHELLAB 公司产品；L5M 型高剪切混合乳化器，英国Silverson公司产品；APV1000 型高压均质机，德国APV 公司产品；PT-20T 型微型超高温UHT 杀菌及充填系统，日本POWERPOINT 公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备（1） 大豆分离蛋白理化指标。蛋白质含量90%，具有特有原料风味。

（2） SPI 乙醇萃取处理。取一定量的SPI 与酒精（50%，W/W）溶液1∶4 进行混合；在搅拌状态下25 ℃保持30 min；以转速10 000 r/min 离心10 min，取沉淀；加水分散，以转速6 000 r/min 高剪切处理10 min；真空度12 kPa，于75 ℃条件下蒸馏，待酒精蒸发完毕，得到蛋白浓缩物。将蛋白浓缩物配制成蛋白含量为10%的蛋白溶液备用。

（3） SPI 溶液。配制质量分数为10%的SPI 水溶液，40～50 ℃水合30 min，以转速6 000 r/min 高剪切处理10 min，备用。

1.3.2 顶空固相微萃取和气相色谱分析

取2.5 g蛋白溶液样品和2.5 g水混合均匀于20 mL顶空瓶中，加入10 μg/mL 的乙酸正戊酯溶液50 μL作为内标，样品在60 ℃恒温下平衡10 min；插入萃取头距离液面0.5～1.0 cm 处，萃取20 min，萃取头老化温度及时间：250 ℃，25 min。然后插入气相色谱仪进行分析，分析条件为进样口温度250 ℃；柱流量0.8 mL/min；分流比5∶1；升温程序：起始温度50 ℃，以2 ℃/min 升至160 ℃，再以15 ℃/min 升至285 ℃保持15 min。离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；传输管线温度285 ℃；电离电压70 eV；扫描范围29～450。

1.3.3 关键风味物质评价

为了更好地分析大豆分离蛋白中关键性风味物质对特征风味的贡献大小，采用风味活性值（OAV）进行评价。OAV 是风味物质的质量浓度与其香气阈值的比值，其值能更加科学地体现某种风味物质对样品整体感官风味的贡献程度，OAV 值越大，则贡献越大[10-11]。

1.3.4 SPI 溶解性及其制备豆奶感官评价

（1） 溶解性评价。分别将大豆分离蛋白（SPI）和乙醇萃取后的大豆分离蛋白（ESPI） 配制蛋白含量3.2%的蛋白溶液，于50 ℃下搅拌溶解30 min，高速剪切10 min，冷却至室温，以转速3 000 r/min离心10 min，测定溶液pH 值、粒径、离心沉淀率，每组溶液测试3 个重复取平均值，评估乙醇处理对SPI 溶解特性影响。

（2） 感官评价。分别利用大豆分离蛋白（SPI）和乙醇萃取后的大豆分离蛋白（ESPI） 制备蛋白含量为3.2%的豆奶，具体操作步骤：将大豆分离蛋白溶于50 ℃水中，水合30 min，加入椰子油、白砂糖、磷脂搅拌溶解，采用高剪切混合乳化器乳化10 min，经20 MPa 均质后进行UHT 杀菌（温度137 ℃，时间4 s），无菌灌装后得到SPI 豆奶和ESPI 豆奶，用于感官评价。

感官分析采用Profiling 评估方法，由12 名专业感官人员对SPI 豆奶和ESPI 豆奶进行品尝评分。豆奶评估指标包括特征风味、脂肪感、口中稠度、顺滑度、后味。其中，特种风味进一步评估了乳香味、豆腥味、生谷物味、豆香味、油味、奶油味指标。评分标准采用10 点标度法：0～1 分为完全没有，2～3 分为轻微，4～5 分为中等程度，6～7 分为强，8～9 分为极强。

2 结果与分析

2.1 大豆分离蛋白挥发性风味物质分析

乙醇萃取前后大豆分离蛋白中挥发性风味物质色谱图见图1，SPI 挥发性风味物质组成见表1。

表1 SPI 挥发性风味物质组成

图1 乙醇萃取前后大豆分离蛋白中挥发性风味物质色谱图

萃取前和萃取后SPI 分别鉴定出31 种、29 种挥发性风味物质，其中近50%的风味物质属于醛类物质。萃取前和萃取后SPI 中的主要挥发性风味成分均为2 - 戊基呋喃、己醛、壬醛、苯甲醛、葵醛、反式- 2 - 辛烯醛等，但经乙醇萃取后SPI 中的挥发性风味物质含量（0.6 mg/L） 较萃取前（2.1 mg/L）明显降低约71%。该结果与已有通过乙醇处理减弱蛋白风味研究结论相符，由于许多醛类、酮类等风味物质能溶于乙醇，通过萃取方式可以有效除去风味物质[9]。

2.2 大豆分离蛋白特征气味成分分析

由于不同风味物质的风味阈值及风味特征不同，SPI 中检测到的明显高于其香气阈值的风味物质。

SPI 中主要风味物质的香气特征及OAV 值见表2，乙醇萃取前后SPI 中主要挥发性风味物质含量变化程度见图2。

表2 SPI 中主要风味物质的香气特征及OAV 值

图2 乙醇萃取前后SPI中主要挥发性风味物质质量浓度变化程度

这些风味物质根据其香气特征分为两类：非豆腥味物质和豆腥味物质。SPI 中主要的非豆腥味物质包括苯甲醛、戊醛、辛醛、壬醛、葵醛、十一醛，其中苯甲醛呈现豆香味，虽然在SPI 中含量较高，但低于其香气阈值（0.35～3.50 mg/L）[12]，且其OAV小于1，并不是贡献SPI 非豆腥味的主要物质。葵醛、壬醛、辛醛、十一醛、戊醛均具有果香味特征，这些风味物质的含量均高于其香气阈值，OAV 值大于1，是赋予SPI 非豆腥味的主要成分；在经乙醇萃取处理后，这些主要非豆腥味成分含量分别减少了45%，43%，59%，52%，94%（见图2），尤其戊醛含量降低至其香气阈值以下，OAV 值小于1，十一醛含量也降低至接近其香气阈值，均不再是非豆腥味的主要成分；对乙醇处理后SPI 非豆腥味贡献较大的成分则主要是葵醛、壬醛和辛醛。

SPI 中豆腥味物质主要包括（按照其风味贡献由大到小依次排序） 2,4 - 癸二烯醛、2 - 戊基呋喃、反式- 2 - 壬烯醛、己醛、1 - 辛烯- 3 - 醇、反式-2 - 辛烯醛、反式- 2 - 庚烯醛，这些风味物质分别呈现油脂味、青草味、泥土味等，且气味阈值较低，是引起SPI 不良风味的主要成分。2,4 - 癸二烯醛呈现深度油脂味，主要是由LOX1 催化13 - 氢过氧亚油酸产生[13]，在SPI 中虽然含量不高，但是其香气阈值极低（0.007 μg/L），对SPI 异味产生的影响最大；经乙醇处理后，其含量明显降低（约82%），但仍是影响SPI 风味的主要因素。2 - 戊基呋喃呈青草味、泥土味、豆味，是由大豆核黄素提供的单线态氧或光敏诱发亚油酸氧化产生[14]，是SPI 中的主要风味成分，也是引起豆腥味的主要物质，经乙醇萃取处理后，SPI 中2 - 戊基呋喃含量降低约78%，OAV 值由132.2 降低至29.3，对豆腥味的影响明显减弱。此时，反式- 2 - 壬烯醛香气阈值较低0.08 μg/L，是由亚油酸自动氧化形成的9 - 氢过氧化物分解产生，具有较好的热稳定性，呈现油炸味[3]，乙醇萃取处理后，其含量未发生变化，说明该风味物质不能通过乙醇萃取方法除去。己醛呈现青草味，是很多大豆制品中引起豆腥味的主要风味物质，其是由LOX2通过催化亚油酸生成13 - 氢过氧亚油酸，再经乙醇脱氢酶分解形成的[7]；SPI 中乙醛含量较高，经乙醇萃取处理后，己醛含量明显降低71%。1- 辛烯- 3- 醇在很多大豆制品研究中也被认为是引起不良风味的主要成分，呈现蘑菇味、泥土味，主要在大豆浸泡过程中产生，是大豆胚芽中的糖苷被β - 糖苷酶水解时从糖苷中解离出来的[15]，乙醇处理对1 - 辛烯-3 - 醇的去除效果较好，约93%的1 - 辛烯- 3 - 醇被除去，终含量（0.002 mg/L） 降低至接近香气阈值（0.001 mg/L）。反式- 2 - 辛烯醛、反式- 2 - 庚烯醛分别呈现脂蜡味、青草味，反式- 2 - 辛烯醛是由LOX1 氧化亚麻酸形成的11- 氢过氧化物分解产生[16]，反式- 2- 庚烯醛主要是由大豆胚芽中的亚油酸经光敏或单线态氧化形成12- 氢过氧化物，在Fe2+作用下分解产生的，受铁离子、pH 值、螯合剂影响较大[17]；经乙醇萃取处理后，其含量分别降低52%，57%，尤其是反式- 2 - 庚烯醛含量（0.014 mg/L） 接近其香气阈值0.013 mg/L。综合分析，除反式- 2 - 壬烯醛外，SPI 中的豆腥味物质的OAV 值在经乙醇萃取处理后均有明显减小，说明乙醇处理能有效减弱SPI的豆腥味，尤其是1 - 辛烯- 3 - 醇和反式- 2 - 庚烯醛均被认为不再是引起SPI 不良风味的主要风味物质。已有研究表明，乙醇水平越高，风味物质的去除效率越高，一方面乙醇能使脂肪氧化酶活性降低，减少风味物质的产生；另一方面由于其极性较低，与风味物质具有更强的亲和力[9]。

2.3 乙醇处理对SPI 溶解性的影响

经乙醇处理后的SPI，溶解后pH 值未发生变化，离心沉淀率和粒径大小有所增加，但是不显著（p＞0.05），说明乙醇处理对大豆分离蛋白溶解性有影响但不显著，与已有研究结果相似[20]。SPI 原料在乙醇洗涤过程中，可能由于溶剂极性低会引起部分蛋白质变性，而在较高乙醇水平下，SPI 中的白蛋白和球蛋白含量的增加及脯氨酸的减少，反而会增加蛋白质的溶解性[9]。试验采用的大豆分离蛋白原料蛋白质含量较高，且在相对高水平乙醇洗涤过程中大部分SPI 处于非溶解状态，其分子结构受到乙醇影响较小，因此溶解性受到的影响也较小。

乙醇处理前后SPI 的理化特性见表3。

表3 乙醇处理前后SPI 的理化特性

2.4 豆奶感官评价

SPI 豆奶和ESPI 豆奶感官评分见图3。

图3 SPI 豆奶和ESPI 豆奶感官评分

由图3 可知，对SPI 豆奶和ESPI 豆奶进行的综合感官评分结果显示，ESPI 豆奶在特征风味、后味、脂肪感、口中稠度上均比SPI 豆奶明显降低，同时顺滑度有所增加。在特征风味上，ESPI 豆奶的生谷物味、豆腥味、油味、豆香味均较SPI 豆奶显著降低，特征风味得到明显改善。与该试验风味成分分析结果相符。感官评价进一步论证了乙醇处理能有效改善SPI 的风味品质。

3 结论

溶剂萃取法除去大豆分离蛋白的不良风味已有相关报道[9，20-22]，该方法工艺简单、成本较低，工业化生产具有可实现性。基于大多数醛类、酮类等风味物质溶于乙醇的原理，通过乙醇洗涤改善SPI 风味的方法具有一定的前景。研究发现，乙醇萃取处理对非豆腥味物质和豆腥味物质都有不同程度的去除效果，尤其对豆腥味去除效果更显著，可能与不同风味物质和蛋白质结合程度不同有关[23]。非豆腥味物质中戊醛含量降低最显著，葵醛、辛醛、壬醛、十一醛的含量分别降低40%～60%。豆香、果香味等非豆腥味的降低有利于SPI 在食品领域应用范围的扩大。豆腥味物质中对异味贡献最大的风味物质是2,4 - 癸二烯醛，其次依次为2 - 戊基呋喃、己醛，1- 辛烯- 3- 醇、反式- 2- 辛烯醛、反式- 2- 庚烯醛。经乙醇萃取处理后，这些豆腥味物质的含量分别降低了82%，78%，70%，93%，52%，57%。由此可见，乙醇萃取对豆腥味物质均有较好的去除效果，尤其是1 - 辛烯- 3 - 醇除去效果最显著，与已有研究结论相符[21]。经乙醇处理SPI 制备豆奶的豆腥味、豆香味、油味也明显减弱，进一步证实了经乙醇处理SPI 风味得到明显改善。很多研究表明，2,4- 癸二烯醛、1 - 辛烯- 3 - 醇、2 - 戊基呋喃、己醛是造成大豆制品青草味和豆腥味的主要物质，研究发现乙醇萃取对这些风味物质均有显著的去除效果，论证了溶剂萃取方法应用于食品工业具有实际意义。