桌面干式培养箱在体外受精胚胎培养中的临床效果观察

董晓慧，师娟子，刘小华，赵正豪，赵小利，李伟，薛侠

(西北妇女儿童医院生殖中心,西安 730000)

从最初进行胚胎体外培养开始,人们就对培养条件进行了各种各样的改进以优化胚胎培养体系,从而达到获得更多优质胚胎的目的。近年来,胚胎培养基的商业化使用使得培养的一致性和效果大大提高,提升了辅助生殖技术的成功率。胚胎培养箱作为胚胎在体外生长发育的场所,在胚胎培养中发挥着举足轻重的作用。

胚胎培养箱尽可能维持胚胎生长所需的最佳pH值、渗透压、温度、空气和湿度[1-4]。为了达到这一目的,培养箱经历了多次改进,从传统的湿式CO2培养箱发展到现在的时差成像(Time-lapse,TL)培养箱。传统湿式培养箱最明显的缺点是箱内的高湿度会使得微生物繁殖加剧,从而可能对胚胎的生长发育产生不良影响[5]。近年来,随着技术的不断发展,桌面干式培养箱由于其灵敏、便捷的特性在IVF实验室的应用越来越广泛。然而,目前关于其胚胎培养的临床效果的研究并不多见。干式培养箱和传统湿式培养箱的主要区别在于箱内环境的湿度差异,这一差异将会对箱内培养皿的渗透压和pH等产生不同的影响。一些研究认为,在干式培养箱中,培养皿表面覆油虽然能有效地控制培养基pH和温度的改变,但对于渗透压的维持效果还有争议[6-7]。因此,干式培养箱的有效性和安全性值得我们关注。

目前尚无关于干式培养箱和传统湿式培养箱的培养效果和安全性的大样本研究。本研究拟通过回顾性分析2019年1月至2022年9月于我院生殖中心就诊行IVF治疗的,在同一培养环境下、相同培养基中,进行胚胎培养患者的临床资料,比较桌面干式培养箱与传统湿式培养箱在胚胎培养中的效果和妊娠结局,以期对干式培养箱的培养效果和安全性提供依据。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2019年1月至2022年9月于我院生殖中心就诊行IVF治疗患者的临床资料。

纳入标准:(1)患者年龄≤40岁;(2)为第1周期治疗;(3)新鲜D3卵裂期胚胎或D5囊胚移植;(4)胚胎或囊胚的移植数为1个。

排除标准:(1)人绒毛膜促性腺激素(HCG)日内膜厚度<7 mm;(2)男女任何一方存在染色体异常者。

本研究共纳入3 177个周期。根据培养环境不同分为两组:以传统湿式箱培养的为C200(湿式)组(n=2 820),以桌面干式培养箱培养的为MIRI(干式)组(n=357)。

本研究方案通过了西北妇女儿童医院伦理委员会的审核,所有患者均签署知情同意书。

二、研究方法

1.促排方案及取卵受精:根据患者自身情况,个体化制定促排卵方案,包括长方案、超长方案、短方案和拮抗剂方案等。根据男方精液情况确定受精方式,行IVF或卵胞浆内单精子注射(ICSI)受精。HCG注射36 h后,经阴道超声引导下,行穿刺取卵术。

患者取卵4～6 h后开始进行授精。IVF在体外洗精受精液(G-IVF PLUS,Vitrolife,瑞典)中进行,ICSI授精在含有30 μl的取卵-胚胎处理液(G-MOPS PLUS,Vitrolife,瑞典)的微滴中进行,授精后转移至含有40 μl的卵裂胚培养液(G-1 PLUS,Vitrolife,瑞典)的微滴中进行培养;16～18 h后,观察并判断受精情况,并根据D3胚胎情况决定是否进行囊胚培养。对于常规IVF,D3需获得≥2枚优质胚胎;对于ICSI受精,D3需获得≥3枚优质胚胎;若未形成优质胚胎,则需可用胚胎数达到5枚,将可用胚胎转移至含有40 μl的囊胚培养液(G-2 PLUS,Vitrolife,瑞典)的微滴中继续进行培养。以上所有的培养过程,C200(湿式)组都是在传统湿式箱(C200,Labotect,德国)中进行,MIRI(干式)组都是在桌面干式培养箱(MIRI,ESCO,新加坡)中进行。

2.胚胎评分:卵裂期胚胎根据Istanbul共识[8]进行评分,分为Ⅰ～Ⅳ级。其中评分在Ⅰ～Ⅲ级的胚胎被认定为可用胚胎,Ⅰ级、Ⅱ级为优质胚胎。囊胚评分依据Gardner标准[9]来进行,按照囊胚扩展程度分为3、4、5、6级,按照内细胞团的细胞数量和紧密程度分为A、B、C级,按照外滋养层的细胞数目和排列紧密程度分为A、B、C级,评分在C级及以上被认定为可用囊胚。D5囊胚评估后依据评分择优移植,余下囊胚进行冷冻保存。

3.胚胎移植及黄体支持:提前1 h将待移植胚胎转移至装载有1 ml 囊胚培养液(G-2 PLUS,Vitrolife,瑞典)的培养皿中。在腹部B超引导下,用移植管装载胚胎放置到子宫内。拟新鲜移植的患者,从取卵日开始黄体支持,方案为每日肌肉注射黄体酮(浙江仙琚)60 mg,同时每日口服地屈孕酮(雅培,美国)20 mg。

4.妊娠结局的判定:卵裂期胚胎移植14 d后,囊胚移植12 d后,检测血清HCG水平,血清HCG≥10 U/L为HCG阳性;移植28 d后,B超检测发现子宫内有孕囊,判定为临床妊娠;子宫以外其他位置探查到孕囊,判定为异位妊娠。

5.主要观察指标:主要评价指标为临床妊娠率、活产率、流产率。次要观察指标为D3优胚率、囊胚形成率、种植率、早产率、胎儿出生体重。临床妊娠率=临床妊娠周期数/新鲜移植周期数×100%;活产率=活产周期数/新鲜移植周期数×100%;流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%;D3优胚率=D3优质胚胎数/正常受精卵母细胞数×100%;囊胚形成率=总的囊胚数/正常受精卵母细胞数×100%;种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%;早产率=孕12周内自然流产周期数/临床妊娠周期数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、一般临床资料比较

两组间女方年龄、体质量指数(BMI)、不孕年限、不孕类型、基础FSH、LH、雌二醇(E2)、窦卵泡数计数(AFC)、总促性腺激素(Gn)比较均无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者一般临床资料比较[(-±s),%]

二、两组患者胚胎培养情况比较。

两组间双原核(2PN)率、D3优胚率、D3可用胚胎率、囊胚形成率比较均无显著差异(P>0.05)(表2)。

表2 两组患者间胚胎培养情况比较[(-±s),%]

三、两组患者临床结局比较

1.移植卵裂期胚胎患者的临床结局比较:选择卵裂期胚胎移植的MIRI(干式)组和C200(湿式)组患者分别有115周期和990周期,MIRI(干式)组的活产率显著高于C200(湿式)组(46.09% vs. 36.06%,P<0.05);两组间胚胎种植率、临床妊娠率、流产率、早产率、双胎率、胎儿出生体重比较均无显著差异(P>0.05)(表3)。

表3 两组患者移植卵裂期胚胎的临床结局比较[(-±s),%]

2.移植囊胚患者的妊娠结局比较:MIRI(干式)组和C200(湿式)组患者选择囊胚移植的分别有242周期和1 830周期,MIRI(干式)组流产率显著高于C200(湿式)组(20.63% vs. 13.20%,P<0.05);两组间囊胚种植率、临床妊娠率、活产率、早产率、双胎率、胎儿出生体重比较均无显著差异(P>0.05)(表4)。

表4 两组患者移植囊胚的临床结局比较[(-±s),%]

讨 论

人体内的环境是潮湿的,因此我们在进行胚胎体外培养时一直在尽可能的模仿这种潮湿的环境。但是近年来关于湿式培养和干式培养的各自优势的研究结果并不一致[10-12]。本研究通过比较在同一实验室环境下、采用相同序贯培养基培养的胚胎在传统湿式培养箱和桌面干式培养箱的培养效果和临床结局,发现两组间D3优胚率、D3可用胚胎率和囊胚形成率比较均无显著差异(P>0.05),此结果与Kirkegaard等[10]和Bartolacci等[11]的一致。然而,Valera等[12]研究发现,胚胎培养采用TL系统和全程培养基并分别采取湿式培养箱和干式培养箱两种培养条件时,湿式培养箱能够获得更高的妊娠率,且这种现象在胚胎植入前非整倍体检测(PGT-A)患者中表现的尤为突出。我们认为,出现这种情况的原因可能是:(1)干式培养对全程培养基的影响更大,渗透压和pH的变化也较湿式培养显著;(2) 活检对囊胚造成了一定的损伤,导致囊胚对干性培养环境所产生的不良影响的抵抗力降低,从而影响其发育潜能。与湿式培养相比较,干式培养最大的变化在于培养基微滴的渗透压的变化。多项研究结果显示,尽管表面覆油,干式培养的培养基微滴随着时间推移(1～7 d)渗透压逐渐升高,而湿式培养的微滴渗透压变化不大,两者的妊娠结局差异较大[13-16]。此外,通过TL系统并采用干式培养箱培养的胚胎,尽管在胚胎选择上有实时图像的加持,其妊娠结局却并不优于传统湿式培养[17-18]。

同时,本研究结果显示,与传统C200(湿式)培养箱相比较,MIRI(干式)培养箱培养的胚胎在卵裂期具有更高的活产率(P<0.05),两组间囊胚期临床妊娠率、活产率和早产率比较均无显著差异(P>0.05),但流产率显著升高(P<0.05)。此结果与Fawzy等[19]研究结果不同,他们的研究认为干式培养的优胚率、种植率、临床妊娠率以及持续妊娠率均显著低于湿式培养。分析其原因发现其研究方法和本研究有很大区别:(1)采用全程培养基,中途不更换培养基;(2)只进行D5囊胚的新鲜移植。我们推测随着时间的推移,干式培养所产生的渗透压逐渐升高和pH改变等不利影响累加在一起,进而影响胚胎生长发育。而本研究结果发现,D3卵裂期胚胎新鲜移植的活产率更高,原因可能是到D3卵裂期培养基的改变尚不足以对胚胎产生足够的不利影响。培养箱的性能指标包括了气体浓度、恢复时间、温度、pH和湿度等,每一项在胚胎培养中都发挥了一定的作用,培养效果也是它们的综合表现[3,20-21]。基于此,有部分研究认为桌面干式培养箱的培养效果更优[22]。桌面干式培养箱由于其单个箱体小,在开箱后温度和CO2浓度的恢复上有很大优势。有研究表明,经过5 s的开箱门,桌面干式培养箱可以在5 min恢复至37℃,而传统湿式培养箱需要20～30 min;同样,开箱门后,桌面干式培养箱需要约3 min恢复气体浓度,而后者需要8 min[23]。所以,我们推测:胚胎培养的前期阶段(D3及之前)更加依赖温度,气体浓度,而对渗透压变化的反应不明显,因此对于D3卵裂期胚胎来说采用桌面干式培养的效果更佳;而对于后期囊胚阶段的胚胎,囊胚对渗透压的影响更敏感,产生了一定的不利影响,因而流产率显著升高。结合以上分析,我们不难发现,与传统湿式培养箱相比,桌面干式培养箱具有以下优点:(1)箱体小巧便捷,开箱后气体浓度、温度等指标恢复更快;(2)箱体内干燥缺水,不利于微生物繁殖,降低了胚胎培养过程中发生污染的风险;(3)与湿式培养箱相比较,桌面干式培养箱D3卵裂期可用胚胎率、优胚率及囊胚形成率无显著差异(P>0.05),而活产率显著升高(P<0.05)。基于此,我们可以认为桌面干式培养箱在胚胎培养的安全性上是值得肯定的。

综上所述,D3卵裂期胚胎及以前阶段的胚胎培养更适合在桌面干式培养箱中进行,能获得更好的培养效果和临床结局;而D4及以后阶段胚胎更适合传统湿式培养,来纠正干式环境对囊胚的影响。但由于本次研究的样本量有限,仍存在出现统计学偏差的可能,今后还需要更大的样本量来验证这一结论。