不同授粉方式对连翘果实农艺性状和品质的影响

薛帼珍，刘佳宁，闫晓睿，杨晓霞，刘计权*

（1.山西中医药大学 中药与食品工程学院，山西 榆次 030619；2.北京协和医学院 药物研究所，北京 100050）

连翘来源于木犀科（Oleaceae）药用植物连翘［Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl ］的干燥果实，秋季果实初熟尚带绿色时采收，习称“青翘”，果实熟透时采收，习称“老翘”，具有清热解毒、消肿散结、疏风散热的功效［1-3］。连翘含有连翘苷、连翘酯苷A、连翘脂素、生物碱、香豆精、毛柳苷等多种化学成分［4-6］。2020版《中国药典》规定，连翘酯苷A和连翘苷为连翘质量评价的2个重要指标成分［1］。

连翘主要分布于山西、河南、河北、陕西、山东等地，以山西和河南产量最大［7-8］。山西是野生连翘资源最丰富的省份，也是野生连翘资源分布的中心，其中太岳山、中条山和南太行山为山西野生连翘的三大分布区［9］。2020年11月11日，山西省卫健委将连翘认定为山西“十大”晋药之一［10］。

近年来，由于我国中医药行业的健康发展，市场对连翘的需求与日俱增，连翘的生产由原来单一依靠野生采集为主逐渐形成了目前的野生抚育、仿野生栽培和人工规范化栽培并存的生产模式［11-12］。根据连翘雄蕊的长短可分为长花柱连翘和短花柱连翘，不同花柱类型之间授粉会影响到连翘后期的坐果率［13］。

本文在以前学者研究的基础上，对连翘不同花柱类型授粉后对连翘果实农艺性状和品质的影响进行了研究，以期为连翘的人工规范化栽培提供一定的参考依据。

1 材料

1.1 仪器与设备

1.2 试药与药材

连翘酯苷A、连翘苷（中国食品药品检定研究院，批号分别为111810-201707、110821-201816）；甲醇［色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；甲醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；娃哈哈纯净水。

药材来源：连翘果实采自山西中医药大学校园内连翘种植区，经山西中医药大学刘计权教授鉴定，确定为木犀科药用植物连翘的果实。

2 方法

2.1 连翘授粉方式

授粉试验在山西中医药大学药用植物园5年生连翘种植区进行，选择连翘长、短花柱2 种类型植株，于2020年4月7 ~ 9日对不同花柱类型的连翘进行授粉试验，授粉后用硫酸纸袋进行套袋。

试验设6 个处理组合：a.长花柱自花授粉（♀长×♂长）；b.短花柱自花授粉（♀短× ♂短）；c.长花柱同型异花授粉（♀长× ♂长）；d.短花柱同型异花授粉（♀短× ♂短）；e.长花柱母本 × 短花柱父本（♀长× ♂短）；f.短花柱母本 × 长花柱父本（♀短× ♂长）。每个处理套袋300 个左右。

2.2 果实农艺性状的测量

2020 年8 月30 日采集青翘，用游标卡尺分别测量不同授粉方式各30 粒鲜果的果长、果宽（在果实最宽处，分别沿腹缝线、背缝线平面进行测定，计算二者平均值作为果宽），不足30粒的全部测量；用电子天平分别称量不同授粉方式各30 粒果实的鲜重和干重，不足30粒的全部称量，计算折干率［14］、单果鲜重和干重［15］。

2.3 连翘酯苷A和连翘苷含量测定

2.3.1 溶液的制备

前三季度，石油和化工行业经济运行保持稳中向好态势。市场供需稳定，价格高位运行，单位成本下降，出口增长加快，整体效益良好。行业供给侧结构性改革稳步推进，经济增长结构进一步优化，企业抗风险能力增强。

2.3.1.1 对照品溶液的制备

精密称取连翘酯苷A、连翘苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含连翘酯苷A 0.979 mg 和连翘苷0.105 mg的混合对照品溶液［16］。

2.3.1.2 供试品溶液的制备

取连翘果实粉末（过五号筛）约0.5 g，精密称定，置50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25 mL，称重，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得［17］。

2.3.2 色谱条件

依据参考文献［18］的色谱条件进行测定。色谱柱：Alltima C18（250 mm × 4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0 ~ 8 min，30% ~33% A；8 ~ 24 min，33% ~ 40% A；24 ~ 39 min，40% ~48% A；39 ~ 55 min，48% ~ 64% A；55 ~ 65 min，64% ~ 30% A；65 ~ 75 min，30% A）；检测波长：280 nm；流速：0.8 mL/min；柱温：室温。

2.3.3 方法学考察

2.3.3.1 线性关系

精密吸取连翘酯苷A 和连翘苷混合对照品溶液6、8、10、12、14、16 μL，依次进样开展色谱分析，以进样量X（μg）为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线，计算得连翘酯苷A 和连翘苷的回归方程和相关系数。

2.3.3.2 方法学试验

制备混合对照品溶液和供试品溶液，按照2.3.2项下色谱条件对其进行含量测定，分别开展精密度试验、重复性试验和稳定性试验，进行方法学试验考察。

2.3.3.3 加样回收试验

精密称取已知连翘酯苷A 和连翘苷含量的连翘药材粉末0.25 g，共6 份，每份均精密加入连翘酯苷A 和连翘苷的混合对照品溶液，按照2.3.1.2 项下方法制备供试品溶液，进行色谱分析，测定峰面积值，计算连翘酯苷A和连翘苷含量及加样回收率。

2.4 含量测定

分别取不同授粉方式产的连翘果实样品3 份，按照2.3.1.2 项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL 进样，按照2.3.2 项下色谱条件测定样品中连翘酯苷A和连翘苷的含量。

2.5 数据处理

采用SPSS 20.0 软件，根据邓肯的多重比较进行显著性分析，显著性界值为P< 0.05。

3 结果与分析

3.1 不同授粉方式对连翘结果率的影响

授粉后于2020年5月8 ~ 9日解袋，统计连翘不同授粉方式的坐果数量，计算结果率。连翘不同花柱类型授粉试验结果见表1。

表1 连翘不同授粉方式结果率的试验结果Tab.1 Experimental results of fruit percentage by different pollination methods

由表1试验结果可以看出，连翘♀长× ♂长（自花）、♀短× ♂短（自花）授粉的结果率均为0.00%；连翘♀长×♂长（同型异花）、♀短× ♂短（同型异花）授粉的结果率非常低，分别为3.81%和5.32%，♀短× ♂短（同型异花）授粉的结果率略高于♀长× ♂长（同型异花）授粉的结果率；连翘♀长× ♂短、♀短× ♂长异花授粉结果率很高，分别达到89.90%和83.49%，♀长× ♂短授粉的结果率略高于♀短× ♂长授粉的结果率。由此可见，生产上连翘果实主要来源于连翘长、短花柱之间的异花授粉。

3.2 不同授粉方式对果实外观性状的影响

连翘不同授粉方式对果实外观性状影响的试验结果见表2。

表2 授粉方式对果实外观性状的影响Tab.2 Effects of pollination methods on fruit appearance traits

表2 测定结果表明，♀长× ♂短异花授粉后，果长、果宽、鲜重、干重、折干率的测定值均表现为最大，其次是♀短× ♂长异花授粉，2 种授粉方式除在果实鲜重、干重方面有显著差异外，在果长、果宽、折干率方面无显著差异；♀短× ♂长异花授粉后果实的5 项测定指标均高于♀短× ♂短（同型异花）授粉的果实，前者的折干率显著高于后者；♀短× ♂短（同型异花）授粉后果实的5项测定指标均高于♀长× ♂长（同型异花）授粉的果实，前者果实鲜重、干重显著高于后者。

3.3 不同授粉方式对连翘酯苷A 和连翘苷含量的影响

3.3.1 线性关系试验结果

连翘酯苷A 和连翘苷混合对照品溶液及连翘供试品溶液HPLC 色谱图如图1 所示。连翘酯苷A和连翘苷线性关系试验结果见表3，结果表明连翘酯苷A 和连翘苷各组分在其相应的线性范围内线性关系良好。

图1 对照品（a）及样品（b）的HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of reference materials （a） and samples （b）

表3 连翘酯苷A和连翘苷回归方程及线性范围Tab.3 Linear range and regression of forsythiaside A and phillyrin

3.3.2 方法学试验结果

对混合对照品和供试品溶液分别进行检测，连翘酯苷A 和连翘苷的精密度试验RSD 值分别为0.23%和1.87%；重复性试验RSD值分别为0.97%和1.33%；稳定性试验RSD 值分别为2.12%和0.17%，结果表明供试品溶液在室温下12 h内稳定。

3.3.3 回收率试验结果

回收率试验测得连翘酯苷A 和连翘苷的平均回收率分别为98.61%和97.54%，对应的RSD 值分别为1.53%和1.72%。表明该方法准确度良好，结果见表4。

表4 连翘酯苷A及连翘苷回收率测定结果Tab.4 Recovery tests of forsythiaside A and phillyrin

3.3.4 不同授粉方式对果实连翘酯苷A 和连翘苷含量的影响

测定结果表明，连翘♀长× ♂短和♀短× ♂长异花授粉后，果实中连翘酯苷A 和连翘苷的含量均高于药典标准，2 种授粉方式之间没有显著差异；连翘♀长× ♂长（同型异花）和♀短× ♂短（同型异花）授粉后，果实中连翘酯苷A 和连翘苷的含量均低于药典标准，2 种授粉方式之间没有显著差异（表5）。

表5 不同授粉方式产连翘果实中连翘酯苷A和连翘苷的含量测定结果Tab.5 Determination of forsythiaside A and phillyrin in fruits of different pollination methods

4 讨论

4.1 自交不亲和性对连翘结果率的影响

在植物界中，自交不亲和性广泛存在［19-21］。连翘的花属于两性花，如果在生长发育过程中因自花授粉而导致近亲繁殖，最终会降低连翘后代对生长环境的适应性，所以在长期的进化过程中，逐渐形成了抑制近亲繁殖的自交不亲和性，如通过花的特征变化，形成长花柱（短花药）花、短花柱（长花药）花来避免自花授粉而产生后代。试验研究表明，♀长× ♂长（同型异花）和♀短× ♂短（同型异花）授粉的结果率也非常低，只有♀长× ♂短和♀短× ♂长之间的异花授粉才能繁殖大量的后代，说明连翘在分子水平上同样形成了基因干预的自交不亲和性。自交不亲和性是一个多基因协同作用的复杂过程［22-23］。在连翘实际生产中，普遍存在坐果率低、产量和质量不均匀等问题，该类问题在某些区域表现的特别严重，而且常年出现连翘光开花不结果的现象［24-25］，其根本原因在于连翘的自交不亲和性，只有不同花柱之间的花授粉才能结果，生产中由于长花柱植株和短花柱植株在一个群落中分布不均匀，导致不同花柱之间的异花授粉受限，进而影响到连翘的结果率［26］。所以在生产中应通过平衡长、短花柱连翘在群落结构中的比例，以提高连翘果实的产量和品质。

4.2 授粉方式对连翘果实性状和品质的影响

药用植物授粉方式不同，来自父母双方的遗传特性也不同，进而会影响到后代的生长发育、药材产量和品质的形成，不同授粉方式产生的果实在农艺性状和活性成分含量上会表现出一定的差异性。研究报道，连翘短花柱花的花粉活力显著高于长花柱花的花粉活力［12，27］，所以将连翘短花柱花的花粉授予长花柱花的雌蕊后，结果率提高。后期果实发育良好，其农艺性状指标（果长、果宽、鲜重、干重、折干率）和品质指标（连翘酯苷A、连翘苷含量）测定值最大；而以长花柱花的花粉授予短花柱花的雌蕊后，其测定值相对较小。2 种同型异花授粉（♀短×♂短、♀长× ♂长）实验结果相比，♀短× ♂短授粉测定值较大，这可能也与短花柱花的花粉活力较高有关。2020 版《中国药典》规定，青翘中连翘苷和连翘酯苷A 的含量分别不低于0.15%和3.5%，还规定青翘含挥发油的含量不得少于2.0%［1］。由于条件所限，本次试验没有进行青翘中挥发油的对比研究，后期将进一步完善研究内容。