薰衣草精油缓释固体分散体的制备及其体外释药性能研究

王园园，顾志荣，郭 燕，毛小文，葛 斌

（1.甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院 药剂科，甘肃 兰州 730000）

薰衣草精油（Lavender essential oil，LEO）是薰衣草（Lavandula angustifoliaMill.）的主要有效成分，是由多种小分子化合物组成的具有挥发性的复杂混合物［1］。薰衣草及LEO 目前尚未被2020 年版《中国药典》收载，但薰衣草收载于《中华本草》《中华人民共和国卫生部药品标准-维吾尔药分册》及《维吾尔药材标准》，具有消散寒气，益胃健脑，燥湿止痛之功效，同时也收载于《欧洲药典》及《美国药典》中［2-5］。LEO 的化学成分主要为芳樟醇、乙酸芳樟酯、1，8-桉叶素、萜品烯-4-醇、罗勒烯、乙酸香叶酯等，其中以芳樟醇与乙酸芳樟酯含量最高［6］。目前对于LEO的研究热点主要集中在其神经系统药理作用与治疗价值方面，如改善睡眠障碍、抗焦虑、抗抑郁、抗狂躁、影响内分泌、治疗偏头痛及神经性疼痛等［7-8］。此外，LEO 还具有抗氧化、解痉、镇痛、抗菌、抗肿瘤、抗突变等作用［5］。国内外对LEO 主要采用吸入疗法与透皮吸收疗法，用于改善睡眠，缓解焦虑、抑郁及头痛，其中采用吸入疗法治疗睡眠障碍使用尤多，多做成含有薰衣草的枕头、香包、粉剂等，但存在疗效不确切，难以量化控制，作用机制不明，携带不便等问题［9］。因此，开发一种安全有效、稳定可控、适于口服、作用持久的治疗失眠的现代LEO新制剂，对于解决上述问题具有实际意义。本研究首次尝试以硬脂酸、PEG 6000和单硬脂酸甘油酯为辅料制备LEO固体分散体，并考察其体外释药性能，以提高LEO溶出，达到缓释效果，长效改善睡眠。

1 仪器与材料

1.1 试验仪器

890B GC-5977A MSD 型GC-MS 联用仪，配备氢火焰离子化检测器（FID），DB-5MS 毛细管柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm），Chemstation 化学工作站（美国Agilent公司）；AL204 型万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；DZF-6090 型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；RCZ-8M 溶出试验仪（天津天大天发科技有限公司）；pHS-3C 型酸度计（上海越平科学仪器有限公司）；SB25-12DTD型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 材料

LEO，购自广州科然精油原料有限公司（精油浓度 ≥ 98%，阴凉遮光保存）；对照品芳樟醇（CHB210217）、乙酸芳樟酯（CHB210623），纯度均 ≥ 98%，均购于成都克洛玛生物科技有限公司；药用级辅料单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇6000、硬脂酸，均符合2020年版《中国药典》标准；丙酮、环己酮，均为色谱纯，均购于天津大茂化学试剂厂；实验用水均为蒸馏水。

2 方法

2.1 LEO 及固体分散体中芳樟醇和乙酸芳樟酯含量测定

2.1.1 GC-MS分析条件

色谱柱为DB-5MS 毛细管柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm），程序升温（起始温度50℃，保持5 min，以2℃/min 升高至100℃，再以3℃/min 升高至150℃，再以8℃/min升高至250℃），载气为氦气（99.99%），流速为1 mL/min，进样量为0.4 μL，分流比为60 ∶ 1，进样口温度为250℃。采用电子轰击离子源（EI），电子能量为70 eV，离子源温度为230℃，接口温度为250℃，扫描方式为全扫描，扫描范围30 ~ 500m/z。

2.1.2 标准储备液配制

分别取芳樟醇和乙酸芳樟酯96.4 mg、52.3 mg，置于10 mL容量瓶中，以丙酮溶解并定容至刻度，配制成浓度分别为9.64 mg/mL、5.23 mg/mL 的混合标准储备液。

2.1.3 供试品溶液制备

精密称取样品15 mg，置于10 mL 容量瓶中，加入环己酮1 mL，以丙酮定容至刻度，即得供试品溶液。

2.1.4 线性关系考察

依次取上述标准贮备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，分别加入10 μL 环己酮作为内标，再以丙酮定容至1 mL容量瓶中，采用“2.1.1”项下条件测定，记录峰面积。

2.1.5 精密度试验

取同一批样品，按“2.1.3”项下方法制成供试品溶液，采用“2.1.1”项下条件连续进样6 次，记录峰面积。

2.1.6 重复性试验

取同一批样品6 份，按“2.1.3”项下方法制成供试品溶液，采用“2.1.1”项下条件进样测定，记录峰面积。

2.1.7 稳定性试验

取同一批样品，按“2.1.3”项下方法制成供试品溶液，分别于0、2、6、8、12 h 按“2.1.1”项下条件进样测定，记录峰面积。

2.1.8 加样回收率试验

精密称取已知芳樟醇和乙酸芳樟酯含量的样品，分别加入芳樟醇和乙酸芳樟酯对照品适量，按“2.1.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1.1”项下条件进样测定，计算回收率。

2.1.9 溶出度测定

精密称取LEO 原料与缓释固体分散体分别装于胶囊中，置于900 mL磷酸盐缓冲液（pH = 7.2）中，采用2020 年版《中国药典》四部规定的“第二法（桨法）”［10］测定，转速50 r/min，水浴温度（37 ± 0.5）℃，分别在0.5、2、4、6、8、12 h 各取样2 mL，同时补充等体积、同温新鲜介质，所取样品经0.45 μm 微孔滤膜过滤，自取样至滤过在30 s内完成，取续滤液，蒸干，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下条件进行测定，计算累积溶出度。

2.2 正交试验优化LEO 缓释固体分散体的处方配比

2.2.1 单因素考察

以硬脂酸 ∶ PEG 6000 ∶ 单硬脂酸甘油酯 ∶LEO = 3 ∶ 4 ∶ 1 ∶ 1 为基准，使其中1 个因素水平变化，其他2个因素水平固定，进行单因素考察。选择硬脂酸/LEO 用量比值（A）、PEG 6000/LEO 用量比值（B）、单硬脂酸甘油酯/LEO 用量比值（C）作为影响因素，以芳樟醇和乙酸芳樟酯总量的累积溶出度（P）为综合评价指标，累积溶出度设3 个考察点P2、P6、P12，分别指2、6、12 h 的累积溶出度，P2、P6、P12分别以30%、65%、90%为标准，则P= 100 - |P2- 30%|- |P6- 65%| - |P12- 90%|，P值越高，表明与所定的标准趋势越接近［11］。

2.2.2 正交试验设计优化处方配比

根据单因素考察结果，A、B、C 等3 个因素各选定3 个水平，按照L9（34）正交表设计试验，因素水平见表1。

表1 正交试验设计因素水平表Tab. 1 Table of design factors for orthogonal test

2.2.3 工艺验证

采用优化出的最佳处方配比制备3批LEO固体分散体，按照“2.1.9”项下方法测定各时间点的P。

2.3 LEO缓释固体分散体的体外释药模型拟合

分别采用零级方程、一级方程、Higuchi 方程、Ritger-Peppas 模型等4 种模型，对12 h 内累积溶出度（P）与释药时间（t）进行曲线拟合，采用拟合系数r判断其拟合程度，r越接近于1拟合越优［12］。

3 结果与分析

3.1 方法学考察

3.1.1 线性关系考察

以进样量为横坐标（X），芳樟醇、乙酸芳樟酯与内标物的峰面积比值为纵坐标（Y），绘制工作曲线，计算回归方程及相关系数r，见表2，总离子流图（Total ion chromatogram， TIC）见图1。

图1 芳樟醇、乙酸芳樟酯和环己酮TIC图Fig.1 TIC diagram of linalool， linalyl acetate and cyclohexanone

表2 芳樟醇和乙酸芳樟酯的回归方程Tab. 2 Regression equation of linalool and linalyl acetate

3.1.2 精密度试验

芳樟醇、乙酸芳樟酯与内标物峰面积比值的RSD分别为1.63%、1.37%，表明仪器精密度良好。

3.1.3 重复性试验

芳樟醇、乙酸芳樟酯与内标物峰面积比值的RSD分别为2.34%、2.65%，表明该方法重复性良好。

3.1.4 稳定性试验

芳樟醇、乙酸芳樟酯与内标物峰面积比值的RSD 分别为2.82%、2.26%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

3.1.5 加样回收率试验

芳樟醇和乙酸芳樟酯的平均加样回收率分别为96.86%和103.41%，RSD分别为2.41%和2.27%。

3.2 单因素试验

当硬脂酸/LEO 用量比值、PEG 6000/LEO 用量比值、单硬脂酸甘油酯/LEO 用量比值分别为3 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1 时P最大，结果见图2 ~ 4，故依此设计正交试验的因素水平。

图2 因素A对P的影响Fig.2 The influence of factor A on P

图3 因素B对P的影响Fig.3 The influence of factor B on P

图4 因素C对P的影响Fig.4 The influence of factor C on P

3.3 正交试验

正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。结果表明，各因素对LEO 缓释固体分散体P影响大小顺序为B > C > A，最佳处方工艺为A2B2C2，即硬脂酸 ∶ PEG 6000 ∶ 单硬脂酸甘油酯 ： LEO = 3 ∶ 5 ∶1 ∶ 1。

表3 正交试验结果Tab. 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析结果Tab. 4 Resultsof variance analysis

3.4 工艺验证

由图5 可知，各时间点P值的RSD 均 < 3%，表明所优选的处方配比工艺稳定、可靠，所制得的缓固体分散体释放速度适宜，在体外能够持续释药12 h，达到了良好的缓释效果，其2 h 的平均释放度为33.43%，6 h 的平均释放度为68.87%，12 h 的平均释放度为92.91%。

图5 3批LEO固体分散体的体外释药曲线Fig.5 Releasecurves of three batches of LEO solid dispersions in vitro

3.5 LEO缓释固体分散体制备工艺

采用熔融法制备，将硬脂酸、PEG 6000、单硬脂酸甘油酯按照3 ∶ 5 ∶ 1 的配比置于70℃烘箱中，待完全熔融后滴加与单硬脂酸甘油酯同比例的LEO，充分搅拌以混合均匀，然后迅速倾倒于冰浴不锈钢板上，涂成薄层，置冰箱中于-20℃冷却6 h，用药勺刮掉凝结的固体分散体，置真空干燥器中充分干燥，待脆化后研细，过80 目筛，即得［13-14］。

3.6 LEO缓释固体分散体的体外释药模型拟合

如表5 所示，一级模型拟合系数r最接近于1，表明一级释药模型拟合度最高。

表5 LEO固体分散体的体外释药模型拟合Tab.5 Release model fitting of LEO solid dispersions in vitro

4 讨论

4.1 LEO治疗失眠的作用机制

薰衣草是蒙医及中医的常用药材，其有效成分是LEO，目前主要采用芳香吸入法治疗睡眠障碍，在民间尤其流行。LEO 能够使实验动物自主活动受到抑制，睡眠时长延长，睡眠潜伏期缩短，但治疗睡眠障碍的分子机制至今尚未完全阐释清楚［15］，其机制可能是通过干扰5-HT 信号通路和GABA 能信号通路来发挥治疗失眠的作用［16］。5-羟色胺（5-HT）是一种作用于睡眠-觉醒周期的重要单胺类物质，是一种能促进睡眠的神经递质［17］。有研究表明［18-19］，薰衣草精油组与模型组相比，薰衣草精油组小鼠脑内5-HT 含量均显著增加，存在极显著差异，而DA、NE 含量均显著减少，存在极显著差异。因此是通过增加脑内5-HT、减少NE 和DA 来达到治疗失眠的目的。GABA是中枢神经中最重要的抑制性神经递质，能够调节正常状态下的睡眠-觉醒周期，通过神经冲动传递至下丘脑和脑干中，抑制该部位控制觉醒的基因的表达，从而改善失眠［20］。有实验结果显示，薰衣草精油组、轻组分组、芳樟醇组均可使大鼠脑内GABA 水平增加，从而增加抑制作用，改善失眠作用［21］。

4.2 体外释放考察的评价指标选取

目前研究认为，LEO 中最主要的活性成分为芳樟醇、乙酸芳樟酯、1，8-桉叶素等，其中又以芳樟醇、乙酸芳樟酯含量最高，该2 种成分含量越高则LEO 的品质越好。因此，本研究建立GC-MS 法测定芳樟醇、乙酸芳樟酯含量的方法，作为体外释放考察的评价指标。

4.3 辅料的选取

本研究在文献调研的基础上，选择硬脂酸、PEG 6000 及单硬脂酸甘油酯作为LEO 缓释固体分散体的制剂辅料。硬脂酸与PEG 6000成形性较好，对油脂类药物的吸收较好，价廉易得，但也存在水溶性较强，溶蚀性能欠佳，药物释放速度难以调节的问题，不利于形成固体分散体的缓释性能。因此选择一种不溶于水的W/O 型辅助乳化剂——单硬脂酸甘油酯配合使用，不仅能够增加基质的整体稳定性，增加硬脂酸与PEG 6000 在水中的溶蚀能力，而且能够调节药物释放的速度，且密度较大可使制备更加容易。

5 结论

本研究先采用单因素考察，在此基础上采用L9（34）正交试验设计优化处方配比，所得最佳配比为硬脂酸 ∶ PEG 6000 ∶ 单硬脂酸甘油酯 ∶ LEO = 3 ∶5 ∶ 1 ∶ 1，三者按照该比例配合使用，是制备LEO 缓释固体分散体的理想选择，所制得的缓固体分散体释放速度适宜，在体外能够持续释药12 h，达到了良好的缓释效果。并通过零级方程、一级方程、Higuchi 方程、Ritger-Peppas 等4 种模型对体外释药进行拟合，其溶出动力学符合一级动力学模型。该实验所优选的处方配比工艺稳定可靠，所得缓释固体分散体能显著改善药物溶出，为其工业化生产奠定了基础。