铁调素水平与骨代谢相关性临床及实验研究

王一可 刘功稳 王雄毅 张睿智 刘炜峰 谢伊代·如则 李俊杰 徐又佳,3*

1. 苏州大学附属第二医院骨科,江苏 苏州 215000

2. 苏州市中医院,江苏 苏州 215000

3. 苏州大学附属第二医院骨质疏松症临床中心,江苏 苏州 215000

铁调素(Hepcidin)近几年已成为国内外研究热点,不仅因为铁调素是体内降低铁水平的“类激素”,还因为其在中风、炎症和急性肝衰竭发病机制中存在许多重要影响作用[1-4]。铁调素是机体铁稳态的主要调节因子,它是由肝细胞分泌的含有25个氨基酸的肽类激素;铁调素能够通过降解肠道上皮细胞表面的铁转运蛋白和肠腔内铁结合,抑制肠道对铁的吸收,同时通过抑制肠道上皮细胞中的铁转运蛋白表达和功能,减少铁的释放进入血液循环[5]。

目前铁调素与骨代谢的相关性主要为铁蓄积是骨质疏松症的独立危险因素[6-7]。铁调素的主要作用是在体内通过降铁进而挽救骨量。同时铁蓄积对成骨细胞增殖和分化存在显著抑制作用,最终抑制骨形成[8-9]。因而,铁调素作为体内影响铁代谢的重要“类激素”,有许多关于“铁调素-骨代谢”方面的研究:例如敲除小鼠体内铁调素基因,小鼠骨量显著减低[10-11];在斑马鱼中敲除铁调素同样表现出成骨抑制等[12]。这些研究多是聚焦于铁调素通过发挥降铁作用,促进骨量恢复。基于铁调素与骨代谢存在相关性的基础研究结果,本研究旨在探讨不同骨密度人群中铁调素水平是否存在差异,铁调素除“降铁作用”外,是否具有独立促进细胞成骨分化的作用,进而分析血清铁调素指标是否在骨质疏松症诊疗中具有临床评估价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1研究对象及分组:收集苏州大学附属第二医院骨科检测过骨密度(DXA,双能X线)的患者资料。纳入标准:①年龄≥50岁绝经后女性;②有DXA检查数据;③有总Ⅰ型胶原氨基末端前肽(P1NP)、I型胶原羧基末端肽(β-CTX)、25-羟基维生素D、甲状旁腺素(PTH)和体质量指数(body mass index, BMI)等相关基线数据。排除标准:①患有骨骼系统疾病(骨肿瘤、骨骼细菌感染等);②属于继发性骨质疏松症;③合并铁代谢异常疾病。根据世界卫生组织在1994年确定的骨质疏松症诊断标准,按骨密度T值将受试者分为两组:①骨质疏松组:髋部和腰椎任一受检部位T值≤-2.5;②骨量正常组:T值>-1.0。

1.1.2实验材料:小鼠颅顶成骨前体细胞MC3T3-E1购自普诺赛生物科技公司(中国);铁调素购自伊莱瑞特生物科技股份有限公司(中国)。

1.1.3主要实验试剂:α-MEM培养基(Gibco,美国);胎牛血清(Gibco,美国);胰蛋白酶(碧云天,中国);青霉素-链霉素双抗溶液(Invitrogen, 英国);β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C(Sigma,美国);CCK-8试剂盒(碧云天,中国);BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天,中国);RNA提取试剂盒(诺唯赞,中国);cDNA逆转录试剂盒(Takara,日本);SYBR Green Supermix(Takara,日本);RT-PCR引物(金唯智,中国);茜素红检测试剂盒(Solarbio,中国);BMP2抗体(abcam,美国);P-SMAD1/5(CST,美国);SMAD5(CST,美国);GAPDH抗体(Affinity,中国);人铁调素ELISA试剂盒(酶联生物,中国)。

1.1.4主要实验仪器:CO2恒温细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific,美国);多功能酶标仪(BioTek,美国);倒置相差显微镜(Carl Zeiss,德国);荧光定量PCR仪(ABI,美国);Western Blot成像系统(上海吉盛,中国)。

1.2 方法

1.2.1血清铁调素蛋白水平检测:收集两组受试者血清,置于-80 ℃保存;运用ELISA试剂盒检测铁调素,标准曲线制备及样品测定方法按照说明书操作;在450 nm波长处检测OD值,根据标准曲线计算各孔浓度。

1.2.2CCK-8实验:将MC3T3-E1细胞以5×107/孔的密度接种于96孔板中。将铁调素重组蛋白溶于无菌PBS中。细胞分盘接种24 h后更换含有不同浓度铁调素(0、1、5、10、50 ng/mL)的α-MEM培养基。细胞培养72 h后,加入CCK-8溶液并在细胞培养箱中孵育30 min。用酶标仪测定溶液在450 nm波长下的吸光度。

1.2.3RT-PCR实验:将MC3T3-E1细胞以5×105/孔分盘接种于12孔板中,用含有不同浓度铁调素(0、1、5、10 ng/mL)的成骨诱导培养基进行成骨分化7 d,按照试剂盒说明书提取细胞总RNA,逆转录cDNA后进行RT-PCR。采用 2-ΔΔCt法计算靶基因的表达水平,引物序列信息见表 1。

表1 各基因的引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4Western Blot:将MC3T3-E1细胞以5×105/孔接种于12孔板中,用含有不同浓度铁调素(0、1、5、10 ng/mL)的成骨诱导培养基进行成骨分化7 d,用含有PI、PPI的RIPA缓冲液制备蛋白。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。等量蛋白在10 %聚丙烯酰胺胶中电泳,转移到PVDF膜上转膜2 h,室温下使用5 %脱脂奶粉封闭1 h,用相应兔抗鼠一抗BMP2(1∶1 000)、P-SMAD1/5(1∶1 000)、SMAD5(1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000), 4 ℃过夜,TBST洗膜,室温下二抗(1∶5 000)孵育1 h。采用ECL化学发光法显影,采用ImageJ软件对各条带灰度值进行定量测定。

1.3 统计学分析

统计分析均使用SPSS22.0版、GraphPad Prism 9.0版进行统计数据、R语言绘制图表。计量数据符合正态分布方差齐,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用ANOVA分析。基于R语言,采用Pearson相关分析进行变量相关关系分析,利用随机森林算法分析各变量对绝经后骨质疏松发病的重要性。P<0.05,认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般数据比较

本研究共入组73例,其中骨量正常组35例、骨质疏松组38例。两组的年龄、身高、体重、BMI相比,未见明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 两组间基础指标比较Table 2 Comparison of basic indicators between two

2.2 骨代谢指标比较

两组受试者总Ⅰ型胶原氨基末端前肽(P1NP)、I型胶原羧基末端肽(β-CTX)、25-羟基维生素D、甲状旁腺素(PTH)之间比较未见明显差异(P>0.05),见表3。

表3 两组间骨代谢指标比较Table 3 Comparison of bone metabolism indicators between two

2.3 铁调素水平比较

收集受试者血清进行分析,结果显示,骨量正常组铁调素水平显著高于骨质疏松组(P<0.000 1),见图1。

2.4 铁调素和腰椎、髋部骨密度间的相关性

Pearson相关系数模型检验分析显示,血清铁调素浓度和髋部骨密度T值间呈现中度正相关性 (R=0.567 ,P<0.001),血清铁调素浓度和腰椎骨密度T值间呈现中度正相关性(R=0.524 ,P<0.001),见图2。

图2 铁调素和腰椎、髋部骨密度的相关性分析Fig.2 Correlation analysis of hepcidin and bone mineral density of lumbar spine and hips

2.5 随机森林算法评估

运用R语言的随机森林算法进行分析,观察误差率(Error)随决策树数目(ntree)的变化情况(ntree值取400～600时误差率趋于稳定)就可评估自变量对绝经后骨质疏松预测的重要性,见图3。因本研究ntree选择为400,得到最佳模型。基于此,根据各自变量通过随机森林中的基尼系数,得到各项指标重要性排序。分析后发现铁调素的基尼系数大于4,证明铁调素在骨质疏松疾病的发生发展中具有重要的影响作用。

图3 随机森林算法评估自身指标在疾病预测中的作用

2.6 CCK-8检测铁调素对MC3T3-E1细胞的增殖作用

用不同浓度铁调素(0、1、5、10、50 ng/mL)分别处理MC3T3-E1细胞72 h。结果显示,铁调素浓度在0～10 ng/mL对MC3T3-E1细胞增殖没有明显促进或抑制。当铁调素浓度高于10 ng/mL时,对细胞的增殖具有显著的抑制作用。见图4。

图4 铁调素对MC3T3-E1细胞增殖的影响Fig.4 Effects of hepcidin on the proliferation in MC3T3-E1 cells

2.7 RT-PCR检测MC3T3-E1成骨基因的表达

用含有不同浓度铁调素(0、1、5、10 ng/mL)成骨诱导培养基诱导MC3T3-E1成骨分化7 d后,RT-PCR检测成骨相关基因表达。结果显示在5、10 ng/mL浓度时,铁调素显著上调了早期成骨基因ALP和Runx2的表达。见图5。

图5 铁调素对MC3T3-E1细胞成骨分化相关基因转录水平的影响Fig.5 Effects of hepcidin on the translation expression of osteogenic differentiation related genes in MC3T3-E1 cells

2.8 蛋白质印迹法检测成骨相关信号通路变化

通过Wester-Blot检测铁调素对成骨分化相关通路蛋白BMP2、P-SMAD1/5和SMAD5表达的影响。结果显示,在浓度为5、10 ng/mL时铁调素促进了成骨分化相关通路蛋白BMP2、P-SMAD1/5和SMAD5的表达。结果表明铁调素通过激活BMP-SMAD通路来促进成骨分化。见图6。

图6 铁调素对MC3T3-E1细胞成骨分化相关通路蛋白的表达Fig.6 Hepcidin regulates the expression of osteogenic differentiation-related pathway proteins in MC3T3-E1 cells

3 讨论

在绝经后骨质疏松症诊疗过程中,血清生物标志物可帮助医生开展临床评估。因此,近些年探索新的骨代谢相关指标研究越来越多。根据已有的动物、细胞实验报道,铁调素与骨量、骨代谢存在相关性[9,13-14]。但是骨质疏松症人群血清铁调素水平如何变化,铁调素是否具有直接调控骨量的作用,目前尚无文献报道。

本研究检测了绝经后女性血清铁调素水平,比较骨量正常、骨质疏松症两组铁调素平均值,结果显示骨质疏松症组的铁调素水平显著低于骨量正常组,这一结果初步提示骨质疏松症存在铁调素水平降低现象。随后分析了铁调素与腰椎、髋部骨密度的相关性,结果显示骨密度(腰椎及髋部)均随体内铁调素水平升高而增加;这提示体内铁调素水平和骨量存在正相关关系,且这种相关性和铁蓄积没有关联。本研究还检测了绝经后女性其他血清骨代谢指标(P1NP、β-CTX、PTH、25OH-VitD),为比较铁调素、P1NP、β-CTX、PTH、25OH-VitD与本研究组人群骨密度变化的相关性,笔者采用随机森林算法进行自变量评估。结果显示,当骨密度作为特征变量,在自变量中,铁调素指标与骨密度相关性最显著(基尼系数9.5)[15]。P1NP、β-CTX常常作为绝经后骨质疏松症骨代谢高转换评估指标,但患者个体差异较大,易收到药物影响[16]。而本研究组的结果中,P1NP、β-CTX与骨密度相关性没有铁调素显著。综合本组研究结果,笔者认为,人群血清铁调素与绝经后骨质疏松存在一定相关性,进一步开展多中心、连续年龄等临床研究对了解铁调素作为绝经后骨质疏松症的评估指标有较好的临床意义。

已有研究认为铁调素在肝脏的表达是通过BMP2-SMAD信号通路进行调控的,BMP与肝细胞膜上的BMP受体结合,该受体磷酸化胞浆SMAD,这些SMAD易位至与SMAD4复合的细胞核,进而激活铁调素基因的转录 ;铁调素是目前发现的唯一在铁稳态中负性调节因子,其降铁作用非常明确[9,17]。铁调素与铁螯合剂(DFO)在铁蓄积状态的骨代谢研究中,除了降低体内铁蓄积作用之外,还存在刺激血管内皮生长因子(VEGF)、提高缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达、促进骨骼的血管生长等作用[18-19]。另外,铁调素直接干预研究也比较有意义。Li 等[20]研究认为铁调素缺乏可通过FOXO3a干扰Wnt/β-catenin通路导致骨量丢失;Guo等[21]研究认为铁调素可促进破骨前体细胞增值和分化,在骨稳态中有负性调节作用;Ma 等[22]研究认为铁调素基因敲除小鼠可呈现低骨量表型。因此,目前研究显示铁调素在骨稳态中有比较明显作用,但在骨形成、骨吸收过程中的确切功能仍有待进一步研究。

本研究的细胞实验中,笔者考虑铁调素肝脏表达主要由BMP-SMAD通路调控 ;同时考虑在骨骼代谢中,BMP2是骨基质中必须生长因子,且BMP-SMAD信号通路可调控下游靶基因促进骨细胞形成[23]。因此,采用铁调素干预成骨前体细胞,希望了解铁调素是否可能通过反馈机制进而激活BMP-SMAD信号通路促进成骨细胞活性。细胞实验结果显示,低浓度的铁调素可以促进成骨前体细胞(MC3T3-E1)骨形成;与对照组相比,加入低浓度的铁调素重组蛋白的MC3T3-E1细胞在mRNA层面呈现更高水平的ALP和Runx2表达,成骨活性增加;另一方面,在MC3T3-E1细胞中加入低浓度的铁调素重组蛋白,与对照组相比,细胞的BMP2、P-SMAD1/5和SMAD蛋白表达量显著增加。这些结果表明,铁调素可能通过调节BMP2-SMAD通路活性,进而促进MC3T3-E1细胞成骨分化。

综上,本研究发现人群血清铁调素水平和骨量呈正相关,成骨前体细胞实验提示铁调素可能通过激活BMP2-SMAD1/5信号通路促进成骨分化。本次研究结果初步说明铁调素水平与绝经后骨质疏松症相关,也为进一步探讨铁调素作为临床评估指标提供了部分实验依据。