脂肪酸代谢对骨质疏松骨骼细胞的影响及中西医干预研究

曹奇 孙广江 戚晓楠 智猛 那俊夫 王洪旭 姚啸生*

1 辽宁中医药大学,辽宁 沈阳 110847

2 辽宁中医药大学附属医院,辽宁 沈阳 110000

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是骨密度减低和骨组织脆弱为主要特点的慢性疾病,使个体易发生脆性骨折,是最常见的骨科疾病之一[1]。骨丢失主要与年龄、女性绝经有关[2],多种危险因素导致脆性骨折,增加死亡率,降低生活质量[3]。鉴于全球老龄人口的迅速增加,OP对个人和社会都造成了相当大的负担[4]。近年来,中医药防治骨质疏松症的研究探索日益增加。骨质疏松症中骨骼改变往往伴随着骨骼肌的退变,基于“骨肉不相亲”理论,提出从脾肾二脏治疗骨质疏松症[5]。进一步探索肌骨协同退变机制中的关键环节,发现鸢尾素可能是影响“脾肾-肌骨”的桥梁因子,其通过减少脂肪含量,对骨组织和骨骼肌产生间接影响[6]。脂肪细胞和成骨细胞具有同源性,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)既可以在骨代谢分化为成骨细胞,亦可在脂代谢分化为脂肪细胞[7-8]。在骨骼出现骨量下降时,往往出现髓腔中脂肪含量上升,过量脂肪累积会促进分泌异常脂肪酸(fatty acids,FAs),通过脂毒性对骨代谢产生负面作用[9-11]。而鸢尾素一方面可直接降低成脂基因的表达,抑制脂肪细胞形成[12],另一方面可以通过增加成熟脂肪细胞能量消耗,减少脂肪含量[13-14],对骨代谢产生积极的影响。

因此,脂肪酸代谢对成骨细胞和破骨细胞进而对OP的发病及病变进程有着重要影响[15-17]。本文基于前期理论基础,分析脂肪酸代谢途径在调节OP中特定细胞中的作用,并进一步探讨基于脂肪酸代谢途径的OP潜在治疗方法及相关药物。

1 脂肪酸的组成、分类及代谢途径

脂肪酸(FAs)是由碳、氢、氧组成的化合物,主链由重复的亚甲基序列聚合,末端连接羧基。脂肪酸的分类,按照是否含有双键,分为饱和FAs(saturated fatty acids,SFAs)和不饱和 FAs(unsaturated fatty acids,UFAs)。根据含有双键的数量,UFAs又可分为单不饱和FAs(monounsaturated fatty acids,MUFAs)和多不饱和FAs(polyunsaturated fatty acid,PUFAs)。也可以按照碳链的长短,分为短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)、中链脂肪酸(medium chain fatty acids,MCFAs)及长链脂肪酸(long chain fatty acids,LCFAs)。脂肪酸代谢分为脂肪酸的合成与分解两方面[18]。近年来,对于脂肪酸代谢在生理功能及病理改变中如何发挥作用有了更加深入的研究[19-20]。

2 FAs与骨骼健康

研究显示,不同类型的FAs在骨骼健康中发挥不同的作用。

2.1 SCFAs与骨骼健康

SCFAs对骨骼健康有重要作用,其作为代谢产物由肠道菌群消化分解过程产生,包括醋酸盐、丁酸盐和丙酸。有研究发现,SCFAs既可直接作用于参与骨代谢的细胞,也可以间接影响免疫炎症反应,与促进骨形成方面联系密切[21]。研究表明,丁酸盐可间接调控骨合成Wnt配体Wnt 10B的基因表达。通过调节调节性T细胞影响骨形成,而调节性T细胞在抑制免疫反应中发挥作用[22]。此外,在饮用水中加入丁酸盐、丙酸盐或醋酸盐可增加正常雌性小鼠的骨量,而在饮用水中添加丙酸盐或丁酸盐可抑制雌激素缺乏小鼠所致的激素依赖性骨丢失[23]。

2.2 LCFAs与骨骼健康

LCFAs同样被发现对骨骼健康有重要作用,是维持骨骼稳态的必要成分。参与维持骨稳态的LCPUFAs主要为n-3类型PUFAs,包括α-亚麻酸(ALA,18∶3 n-3)、二十碳五烯酸(EPA,20∶5 n-3)和二十二碳六烯酸(DHA,22∶6 n-3);n-6类型PUFAs,包括亚油酸(LA,18∶2 n-6)和花生四烯酸(AA,20∶4 n-6)。

2.2.1n-3 LCPUFAs对骨骼的正性作用:有证据表明,n-3 LCPUFAs对骨骼健康有益[24]。用鱼油喂养老年性OP模型小鼠,可减缓骨髓脂肪组织扩张和造血骨髓萎缩,防止骨质流失[25]。Wu Y等[26]应用代谢组学检测发现,多代传代导致衰老成骨细胞更严重的氧化应激损伤,这可能与n-3多不饱和脂肪酸水平的降低有关,适当摄入n-3PUFA可能延缓老年性骨质疏松症的发生。同时,n-3 LCPUFA抑制破骨细胞生成,降低前列腺素E-2含量,从而增加骨密度,对OP有较好的干预及预防作用[27-28]。研究表明,PMOP患者增加n-3 PUFA摄入后,股骨及腰椎骨密度增加,骨折风险降低[29]。此外,脂肪酸中的棕榈酸等,具有促进相关能量产生而促进成骨细胞分化发育的作用,因此可以帮助骨形成[30]。

2.2.2n-6 LCPUFAs对骨骼的负性作用:n-6PUFAs在骨代谢中发挥负面作用[31]。n-6 PUFAs不仅可以抑制成骨细胞的形成和诱导MSCs的脂肪生成,还可以减弱OPG/RANKL的表达[32]。这两种脂肪酸在细胞膜磷脂双分子层的结构和功能中都发挥着重要作用,作为脂质介导的信号分子的前体,可能因此影响骨重塑过程。属于n-6PUFAs的AA和PGE2通过上调 PPARγ依赖性途径和下调 Runx2促进MSCs向脂肪细胞分化,从而引起成骨细胞的生成降低、减少成骨,同时上调环氧化酶(cyclooxygenase-2,COX-2)的表达,使PGE2生成增多,抑制骨生成[33]。低n-6/n-3多不饱和脂肪酸比率的下调显著增加了骨密度[34]。

3 脂肪酸代谢对骨质疏松骨骼细胞的影响

基于脂肪酸在骨骼细胞分化中作为信号转导分子的作用,近年来越来越多的研究集中于不同类型的脂肪酸在骨骼细胞分化中的相关作用功能[35]。不同的脂肪酸代谢途径相互交叉,任何一条途径的激活都可能促使成骨细胞、破骨细胞发生生理病理的改变,影响OP的病理进程。

3.1 脂肪酸代谢对成骨细胞的影响

3.1.1脂肪酸对成骨细胞分化转录因子PPARs的作用:成骨细胞由各种转录因子调控下分化成熟,从间充质干细胞、前成骨细胞、未成熟成骨细胞直至成熟成骨细胞[36]。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是调控成骨细胞分化的重要转录因子之一,其亚型PPARγ多态性与PMOP风险之间的关系已被报道[37]。作为PPAR-γ配体的特定脂肪酸决定了其抗成骨细胞或促脂肪细胞的双重功能。LCPUFAs和AA代谢产物PGE2被认为是PPARs[38]的配体。AA、LA、ALA、EPA等脂肪酸可与PPARα和PPARγ[39]结合。n-6 AA处理后,分化为成骨细胞的人间充质干细胞的成脂基因PPARγ2[40]表达增加。PPARγ与15 d-PGJ2结合,激活脂肪生成,并负向干预Wnt/β-catenin信号途径,阻碍成骨细胞的分化[41]。补充DHA作为成骨细胞膜的脂质成分,已被证明可诱导间充质干细胞的广泛重塑,这决定了成骨细胞的细胞特异性特性。DHA引起的质膜改变通过上调质膜上被称为Akt的蛋白激酶B的磷酸化来增强MSCs的成骨分化。这提出了一种新的机制,通过膳食脂肪酸调节成骨分化[42]。花生四烯酸是一种PPARγ激活剂,可以调节骨髓间充质干细胞分化发育为脂肪细胞,阻碍成骨细胞发育[43]。

3.1.2脂肪酸对成骨细胞分化标志物碱性磷酸酶的作用:Takashi K等[44]利用MC3T3-E1细胞研究了短链脂肪酸是否在成骨细胞中被吸收并影响早期成骨细胞分化。在MC3T3-E1细胞中,醋酸盐和丙酸盐上调了成骨细胞分化标志物碱性磷酸酶的活性,且乙酸盐在处理9 d后上调了碱性磷酸酶mRNA表达,而丁酸盐则没有上调。丁酸盐比乙酸盐和丙酸盐吸收得更快,吸收程度也更大。这些结果表明短链脂肪酸在成骨细胞中起作用,尤其是乙酸和丙酸直接调控了原代成骨细胞的分化。因此,醋酸盐和丙酸盐可能有助于维持骨转换的正平衡。Khosla S[45]等提出,丁酸可以促进提高小鼠体内成骨细胞的数量,促进骨形成。Schroeder TM等[46]经实验得出,用500 nmol/L丁酸盐培育的小鼠颅骨,其培养基中碱性磷酸酶含量明显升高,而体外实验中,丙戊酸盐同样可以激活提升原代成骨细胞的生物活性。Jafarnejad S等[47]发现脂肪酸中的丁酸可以调节BMSCs分化发育为成骨细胞,同时产生骨骼内矿化的骨结节,增强骨形成。

3.2 脂肪酸代谢对破骨细胞的影响

3.2.1脂肪酸对破骨细胞分化RANKL途径的影响:破骨细胞属于巨噬细胞,具有特异性吞噬病变及衰老骨组织的特点。其由原始的干细胞分化成巨噬细胞集落形成单位,即破骨细胞前体细胞。经RANKL-RANK途径调控,分化为单核破骨细胞,最后聚集成多核破骨细胞,即成熟破骨细胞[48]。目前已有课题针对PUFA对RANKL和破骨细胞分化的抑制作用进行实验。在Boeyens JC等[49]的研究中,n-6 AA和n-3 DHA通过下调破骨细胞前体细胞RAW264.7小鼠巨噬细胞中破骨细胞特异性基因TRAP和组织蛋白酶K,有效下调了RANKL介导的破骨细胞生成。在PMOP小鼠模型中,含有n-3 PUFA的南极磷虾油(AKO)经实验验证可以通过抑制PGE2及其受体EP4的分泌,下调OPG/RANKL/NF-κB信号通路,降低破骨细胞生成,而含有n-6 PUFA的花生四烯酸(AAO)作为PGE2的前体,却会通过激活相同的通路来促进骨吸收,加重OP[50]。因此,通过增加内源性PGE2的产生,改变饮食中n-6/n-3 PUFAs对n-6的比例可导致骨吸收增加,从而激活破骨细胞生成相关OPG/RANKL/NF-κb通路[51]。

3.2.2脂肪酸对破骨细胞分化相关标志物的影响:Resolvin E1(RvE1)是EPA的衍生物,是一种有效的促分解脂质介质,可减少破骨细胞介导的骨丢失。RvE1通过抑制破骨细胞前体细胞RAW264.7中RANKL调控的破骨细胞特异性基因及转录因子c-fos和活化T细胞核因子1(NFATc1)mRNA的表达发挥抑制作用[52]。此外,有研究发现富含omega-3 FAs的鱼油抑制了RANKL通路介导的RAW264.7细胞破骨细胞分化的上调[53]。在Song J等[54]的研究中发现,ALA通过下调破骨细胞分化相关标志c-Fos、c-Jun和NFATc1,转录因子蛋白酒石酸抗酸性磷酸酶(TRAP)、破骨细胞相关免疫球蛋白样受体(OSCAR)和组织蛋白酶K,抑制RANKL介导的破骨细胞发生。在小鼠实验模型中,DHA通过与g蛋白偶联受体120(GPR120)结合,减少巨噬细胞中破骨细胞相关细胞因子TNF-α的产生,从而抑制脂多糖(LPS)诱导的破骨细胞形成[55]。Kim HJ等[56]的研究表明,DHA通过抑制NF-kB和MAPKs激活,抑制RANKL调控的原代巨噬细胞分化至破骨细胞。属于短链脂肪酸的丁酸可以降低组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的生物活性[57],而曲古丁酸钠(NaB)和抑菌素A(TSA),两种HDAC抑制剂,可以通过调节破骨细胞特异性信号发挥其抑制作用,证实HDAC可以调节破骨细胞的生成[58]。

4 基于脂肪酸代谢途径的骨质疏松潜在治疗药物

现阶段,针对OP的治疗主要围绕增强骨形成、减少骨吸收,本文进一步探讨基于脂肪酸代谢途径的OP潜在治疗药物,揭示脂肪酸代谢对OP的重要作用。

4.1 基于脂肪酸代谢途径治疗骨质疏松症的潜在现代药物

在Cungo等[53]最近的一项研究中发现,用鱼油(EPA和DHA)补充罗格列酮处理的小鼠具有更高的骨密度,同时降低COX-2活性和促炎细胞因子IL-6和TNF-α,提升抗炎细胞因子和抗破骨细胞因子IL-10。此外,应用200 mg/kg和400 mg/kg剂量富含单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸酯(PUFA)的萝卜油显著降低了OP大鼠的组织蛋白酶K(在OP啮齿动物模型中,组织蛋白酶K在骨吸收过程中由破骨细胞分泌,导致矿物质成分和骨基质降解)和TNF-αmRNA表达水平,但提高了Osx mRNA的表达水平,同时观察发现标本股骨干皮质骨厚度增强、股骨头骨小梁厚度增加[59]。有研究发现,雌性大鼠在补充n-3 PUFA后,破骨细胞因子RANKL、TNF-α和IL-6的表达下降,同时子代雄性大鼠的骨体积增加,成骨细胞的数量提升,破骨细胞下降[60]。硫酸软骨素(CS)是一类硫酸化的糖胺多聚糖,16 S rRNA测序和代谢组学分析表明,硫酸软骨素干预可减少低钙喂养大鼠肠道菌群短链脂肪酸的合成,减缓炎症反应,抑制破骨细胞分化,促进钙吸收和抗氧化机制,减轻OP[61]。

4.2 基于脂肪酸代谢途径治疗骨质疏松症的中药

补骨生髓方[62]、二仙汤[63]和贞术调脂方[64]等中药成方和中药单体葛根素[65-66]、吴茱萸皂苷[67]同样被证实通过调节脂肪酸代谢可起到治疗OP作用。临床观察表明补骨生髓方治疗PMOP疗效显著,高剂量组最佳。血清代谢组学显示,在测量肠道菌群发现,乙酸含量升高,己酸含量下降,为中药治疗PMOP提供依据[62]。研究表明,二仙汤可显著提升血清中n-3 PUFAs 含量,调节脂肪酸代谢,治疗卵巢切除后导致的PMOP模型[63]。经代谢组学鉴定OP小鼠NPD1和AA两种脂肪酸类成分,证实OP的发生发展可能与脂肪酸代谢有关,而贞术调脂方可改善模型组小鼠胫骨和股骨BMD、骨小梁数目、宽度等,其作用机制可能是通过调节脂肪酸代谢,平衡骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化[64]。葛根素灌胃后,去卵巢大鼠股骨BMD提高,气相色谱检测到给药组与模型组肠道代谢物短链脂肪酸数量存在差异。由此推测葛根素通过调控短链脂肪酸数量从而治疗OP[65]。LiB等[66]应用血清代谢组学,发现应用葛根素(PUE)干预去卵巢大鼠时,有23种不同的代谢产物发生变化,与PUFAs代谢途径密切相关。同时发现骨代谢指标与不同的代谢产物,特别是n-3/n-6 PUFA之间存在密切关系。最后证实PUE通过调节PUFA生物合成及磷脂代谢,减少去卵巢大鼠骨髓基质干细胞的脂肪分化,增加成骨分化,从而起到治疗OP的作用。Sheng YM等[67]利用超高性能液体串联四极杆飞行时间质谱仪(UPLC-Q/TOF-MS)对PMOP大鼠尿液代谢谱进行潜在生物标志物筛选,结果显示吴茱萸皂苷可通过影响花生四烯酸代谢对PMOP有治疗作用。

5 小结

近年来,针对OP脂肪酸代谢的研究日益受到重视,了解其代谢途径在各种骨细胞类型中的生理、病理功能十分必要。骨细胞的功能及相互作用与脂肪酸代谢关系密切,脂肪酸代谢途径及产生的各类物质在骨细胞的分化发育、骨内环境稳态均发挥了重要的作用。了解OP中这些脂肪酸代谢异常的机制,将为其治疗方法开辟新的途径。然而,目前针对OP骨细胞脂肪酸代谢途径的研究仍较少,仍需通过代谢途径中关键酶的检测验证其作用,并通过机制研究进一步探讨其与OP骨骼细胞的相互关系。