燕麦米酒发酵工艺优化及其抗氧化活性研究

杨 州，曹露露，刘邱阳，张增明，董良君，镇 达*

（1.湖北工业大学 生物工程与食品学院 发酵工程教育部重点实验室 工业发酵省部共建协同创新中心工业微生物湖北省重点实验室，湖北 武汉 430068；2.孝感亲亲生物科技有限公司，湖北 孝感 432100）

燕麦作为一种全价营养谷物，不仅富含蛋白质、膳食纤维、多种氨基酸及硒、钼、锰等微量元素，而且含有多种生物活性成分，如β-葡聚糖、黄酮和皂苷等[1]，同时其含有丰富的多酚化合物，主要有阿魏酸、香豆酸、咖啡酸、香草酸等[2]。常年食用燕麦具有降血脂、增强免疫力、美容、减肥等保健作用[3-6]，符合现代我国居民对膳食的更高追求。

米酒作为我国传统发酵型食品，以糯米为主要原材料，经过蒸煮糊化后接种酒曲发酵等工艺制得，其富含多种氨基酸、维生素、生物活性肽，成为消费者青睐的功能性饮品[7-9]。目前，复合型米酒的研究是新型米酒发展趋势之一。杜亚飞等[10]将黑青稞与糯米按质量比2∶1混合发酵，酿造出具有黑青稞独特香味的米酒。贺祺涵等[11]将黑米、荞麦、糯米混合发酵，酿造出口感醇厚，风味成分丰富，具有抗氧化能力的米酒。燕麦用于米酒的开发研究较少，传统工艺为将燕麦和糯米按一定比例混合，经过浸泡、蒸煮发酵后制成醪糟[12]。部分地区直接采用燕麦仁浸泡蒸煮，接种甜酒曲发酵为“甜醅”。而燕麦仁种皮较厚，发酵过程中微生物较难利用，影响其原料利用率[13]，此外，燕麦的粒度不同使得发酵时蛋白质、脂肪、碳水化合物和灰分等营养成分的转化率有所差别，进而影响醪糟的口感和香味[14]。

本研究以糯米和燕麦为原料制备燕麦米酒，为了充分利用燕麦原料营养价值和功能特性，通过改变燕麦原料使用方法，将燕麦粉液化后添加到米酒的发酵过程，同时以酒精度及感官评分为评价指标，通过单因素试验及响应面试验优化燕麦米酒发酵工艺，并对其品质指标及抗氧化活性进行分析，旨在解决其传统工艺中出酒率低和风味不佳的问题。燕麦米酒的研发不仅增加复合型米酒的种类和保健功效，同时可使燕麦的深加工得到进一步应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

燕麦：张家口建军燕麦食品有限公司；糯米：孝感市售；甜酒曲、黄酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、葡萄糖、氢氧化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；中温淀粉酶（4 000 U/g）：天津市大茂化学试剂厂；没食子酸、福林酚试剂（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ）（均为分析纯）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PAL-102/104手持酒度计：杭州齐威仪器有限公司；DK-8D恒温水浴锅：常州诺基仪器有限公司；ZWY-2102C恒温培养器：上海智城分析仪器制造有限公司；TGL-16M立式冷冻离心机：常州市金坛高科仪器厂；VWRUV-1600PC紫外可见分光光度计：美国VWR公司。

1.3 方法

1.3.1 燕麦米酒的发酵工艺流程及操作要点

（1）燕麦米酒液化发酵工艺流程及操作要点[15]

操作要点：

燕麦汁的制备：挑选无霉变燕麦，利用粉碎机将燕麦粉碎后，过40目筛备用。将粉碎得到燕麦粉与纯水按1∶8（g∶mL）的比例混合，于90 ℃水浴加热30 min糊化。取出，待燕麦粉浆冷却至65 ℃时，以15 U/g加酶量加入中温淀粉酶（4 000 U/g），液化15 min，得到燕麦汁，冷却至30 ℃备用。

糯米清洗浸泡：选取优质糯米，清洗3次后，于室温下浸泡12 h，待手可捻碾碎籽粒停止浸泡。

蒸饭：将浸泡好的糯米使用蒸锅常压蒸汽20 min，使米中淀粉充分糊化，至米粒通透不软烂且无白心的程度。

摊凉：将蒸煮好的糯米放置通风处，摊凉使米饭温度降至30 ℃左右。

接种甜酒曲：向摊凉后的米饭中接种7‰甜酒曲（以干糯米质量计），从边缘向中心堆砌，当糯米剩余1/3时，只添加边缘，让中间低于外边缘，即四周高，中心低，呈窝状。

糖化：拌曲均匀后装入烧杯中，于恒温培养箱中30 ℃糖化2 d，得到糖化醪。

接种酵母：以糯米干质量计，称取0.1%的活性干酵母溶于10倍质量体积的2%葡萄糖溶液中，于37 ℃水浴活化20 min，将活化后的活性干酵母按0.10%的接种量接种于糯米糖化醪。

添加燕麦汁：加入20%燕麦汁。

发酵：置于30 ℃恒温培养箱中密封发酵4 d。

过滤、装瓶灭菌：发酵完成后，醪液用双层无菌尼龙布过滤，分装至无菌玻璃瓶，巴氏灭菌（65 ℃、30 min），冷却后即为燕麦米酒成品。

（2）燕麦米酒半固态发酵工艺流程及操作要点[16]

糯米和燕麦仁→清洗→浸泡→蒸饭→摊凉→接种甜酒曲→糖化→接种酵母→加水→发酵→过滤→装瓶杀菌→燕麦米酒

操作要点：

清洗浸泡：挑选无霉变的糯米和燕麦仁，清洗干净后，按质量比5∶1混合均匀后于室温下浸泡12 h，待手可捻碾碎籽粒停止浸泡。

蒸饭：将上述充分浸泡的糯米和燕麦放入蒸锅常压蒸汽20 min，至米粒通透不软烂且无白心，燕麦疏松而不糊的程度。

摊凉：将蒸煮好的糯米燕麦混合米饭放置通风处，摊凉使混合米饭温度降至30 ℃左右。

接种甜酒曲：向摊凉后的混合米饭中接种7‰甜酒曲（以糯米和燕麦总干质量计），从边缘向中心堆砌，当混合米饭剩余1/3时，只添加边缘，让中间低于外边缘，即四周高，中心低，呈窝状。

糖化：拌曲均匀后装入烧杯中，于恒温培养箱中30 ℃糖化2 d，得到糖化醪。

接种酵母：以糯米和燕麦仁干质量计，称取0.1%的活性干酵母溶于10倍质量体积的2%葡萄糖溶液中，于37 ℃水浴活化20 min，将活化后的活性干酵母按0.10%的接种量接种于糯米和燕麦糖化醪。

加水：以糯米和燕麦仁干质量计，加入无菌水，料液比为1∶1（g∶mL）。

发酵：置于30 ℃恒温培养箱中密封发酵4 d。

过滤、装瓶灭菌：发酵完成后，醪液用双层无菌尼龙布过滤，分装至无菌玻璃瓶，巴氏灭菌（65 ℃、30 min），冷却后即为燕麦米酒成品。

1.3.2 燕麦米酒发酵工艺优化单因素试验

以感官评分及酒精度为评价指标，在酵母菌接种量0.10%，发酵温度30 ℃，发酵时间4 d，燕麦汁添加量15%的基础条件下，每次只改变4个因素中的一个因素，保持其他因素不变，分别考察酵母菌接种量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、发酵温度（24 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、发酵时间（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d）、燕麦汁添加量（10%、15%、20%、25%、30%）对燕麦米酒品质的影响。

1.3.3 燕麦米酒发酵工艺优化响应面试验

在单因素试验结果的基础上，以酵母接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）及燕麦汁添加量（D）为影响因素，燕麦米酒感官评分（Y）为响应值，利用响应面法优化燕麦米酒发酵工艺。响应面试验设计因素与水平见表1。

表1 燕麦米酒发酵工艺优化响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization of oat rice wine

1.3.4 检测方法

出酒率的测定：参考张慧娟等[17]的方法。发酵原料的质量记为M原料，将发酵后的醪液过滤，用量筒测定其体积并记为V酒，计算出酒率，其计算公式如下：

酒精度的测定：参考GB/T 5009.225—2023《酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》[18]；总酸含量的测定：参考GB/T 13662—2018《黄酒》[19]；还原糖含量的测定：参考刘浩[20]的方法；总多酚含量的测定：参考严莎莎等[21]的方法。

米酒稀释操作：分别量取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL的两种米酒样品定容至20 mL，并对稀释过的米酒样品进行抗氧化能力测定。DPPH自由基的清除活性的测定：根据金海炎等[22]等的方法；ABTS自由基清除活性的测定：根据吴双从等[23]的方法；铁离子还原/抗氧化能力（ferric ion reducing/antioxidant power，FRAP）测定：根据程宏桢等[24]的方法。

感官评分：由食品工程专业的师生共计10人组成的感官评价小组，根据NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》[25]要求，分别对燕麦米酒的色泽、香气、口感和风格进行感官评分，具体评分标准见表2。

表2 燕麦米酒感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of oat rice wine

1.3.5 数据处理与分析

应用Origin2021软件进行数据统计分析。采用Design-Expert 8.6.0.1进行响应面设计及试验分析。使用SPSS26.0对数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 两种发酵工艺对出酒率的影响

两种发酵工艺对出酒率的影响见图1。

图1 两种发酵工艺对燕麦米酒出酒率的影响Fig.1 Effects of two kinds of fermentation process on the yield of oat rice wine

由图1可知，燕麦粉液化后发酵的出酒率显著高于燕麦仁半固态发酵的出酒率（P＜0.05），且在发酵4 d时的出酒率（187%）比燕麦仁半固态发酵提高了40.6%。分析其原因可能为：燕麦种皮较厚，发酵过程中微生物较难利用其中淀粉，醪液中的总糖含量相对较低，导致其酒精发酵过程变慢，出酒率较低；而将燕麦粉碎进行酶解后，解决了燕麦种皮影响其原料利用率的问题，同时酶解后加入，为醪液提供大量糖类，酒精发酵过程加快，出酒率提高。

2.2 燕麦米酒发酵工艺优化单因素试验

2.2.1 燕麦汁添加量对燕麦米酒品质的影响

不同的燕麦汁添加量对燕麦米酒品质的影响见图2。

图2 燕麦汁添加量对燕麦米酒品质的影响Fig.2 Effect of oat juice addition on the quality of oat rice wine

由图2可知，随着燕麦汁添加量的增加，由于酒样的稀释导致燕麦米酒的酒精度逐渐下降。当燕麦汁添加量为10%～20%时，感官评分随燕麦汁的添加而增加，燕麦米酒的香气逐渐显现以及风格逐渐突出；当燕麦汁添加量为20%时，燕麦米酒的感官评分达到最大值83分。随着继续添加燕麦汁，酒样酸甜比失调，酒香不足，口感寡淡，米酒浑浊，色泽较差，燕麦米酒的感官评分有所下降。因此，确定燕麦汁添加量为15%、20%、25%，用于响应面试验设计。

2.2.2 酵母菌接种量对燕麦米酒品质的影响

酵母接种量对酒精度和发酵产物影响很大，酵母接种量的多少决定着酵母菌生长速率、发酵速率[26]。因此，考察酵母菌接种量对燕麦米酒品质的影响，结果见图3。

图3 酵母菌接种量对燕麦米酒品质的影响Fig.3 Effect of yeast inoculum on the quality of oat rice wine

由图3可知，酵母接种量的多少决定着酵母菌生长速率、发酵速率和呼吸产能等变量的大小[27]。随着酵母菌接种量的增加，燕麦米酒的酒精度逐渐增加。当酵母菌接种量为0.05%时发酵力较低，燕麦米酒的甜味突出，酒味和香气不足，感官评分较低；当酵母菌添加量达到0.15%时，燕麦米酒的感官评分达到最大值82分。而酵母接种量继续增大，对酒的风味产生不良影响，米酒酒味过重并带有苦涩味，气味较刺鼻，导致燕麦米酒酒体不协调，感官评分下降。因此，确定酵母菌接种量为0.10%、0.15%、0.20%，用于响应面试验设计。

2.2.3 发酵时间对燕麦米酒品质的影响

发酵时间的长短对酒精发酵和风味也可能产生影响。为此，考察发酵时间对燕麦米酒品质的影响，结果见图4。

图4 发酵时间对燕麦米酒品质的影响Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of oat rice wine

由图4可知，随着发酵时间的延长，酵母菌不断将糖分转化成酒精，酒精度不断上升。并在发酵10 d后，酒精度达到最大值，为10.2%vol。然而感官评分呈现先上升后下降的趋势，当发酵4 d时，酒味和香气开始凸显，燕麦米酒的酒体更加协调，感官评分达到最大值85分。分析原因可能是，发酵前期，由于还原糖含量偏高，导致甜味突出，酒味不足；发酵时间过长，米酒口感欠佳，出现酸味和苦涩味，感官评分下降。因此，确定发酵时间为2 d、4 d、6 d，用于响应面试验设计。

2.2.4 发酵温度对燕麦米酒品质的影响

发酵温度对燕麦米酒品质的影响见图5。

图5 发酵温度对燕麦米酒品质的影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on the quality of oat rice wine

由图5可知，较低的温度会影响发酵过程，同时不利于燕麦米酒感官品质，随着发酵温度升高，燕麦米酒的酒精度逐渐上升，感官评分逐渐增加。当发酵温度达到30 ℃时，感官评分达到最大值82分。此时酒体柔和清爽，风味协调，醇香和麦香兼具。发酵温度超过30 ℃时，感官评分下降，分析原因可能为发酵速度过快，发酵产物不利于米酒整体风味[28]，其酒体掺杂异味，苦涩味明显，口味偏酸，酒体不协调。因此，确定发酵温度为28 ℃、30 ℃、32 ℃，用于响应面试验设计。

2.3 燕麦米酒发酵工艺优化响应面试验结果与分析

在单因素试验结果的基础上，以酵母接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）及燕麦汁添加量（D）为影响因素，燕麦米酒感官评分（Y）为响应值，利用响应面法优化燕麦米酒发酵工艺，试验设计及结果见表3，方差分析见表4。

表3 燕麦米酒发酵工艺优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization of oat rice wine

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.6.0.1对表3结果进行多元回归拟合分析，获得响应值感官评分（Y）的回归模型方程式：

由表4可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），表明试验结果与回归模型之间具有良好的拟合度。决定系数R2为0.950 7，校正决定系数R2adj为0.901 5，说明该模型拟合度较高。由F值可知，各因素对燕麦米酒感官评分的影响程度由大到小依次为C（发酵时间）＞B（发酵温度）＞A（酵母菌接种量）＞D（燕麦汁添加量），由P值可知，一次项A、B、C，交互项BC，二次项B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），其他项对结果影响不显著（P＜0.05）。

响应面图可以比较直观地表现出两变量对因变量的影响关系，进一步分析发酵时间及发酵温度间交互作用对燕麦米酒感官评分的影响，绘制响应面及等高线，结果见图6。

图6 发酵温度及发酵时间交互作用对燕麦米酒感官评分影响的响应曲面与等高线Fig.6 Response surface plot and contour lines of effects of interaction between fermentation temperature and time on sensory score of oat rice wine

响应面坡度越陡，等高线越接近椭圆，表明二者相互作用越显著[29]。由图6可知，交互项BC响应面坡度较陡，等高线密集且呈椭圆，说明发酵时间和发酵温度之间的交互作用对感官评分有极显著影响，与表4方差分析结果一致。

采用Design-Expert8.6.0.1软件对二次多元回归模型进行分析并求解，得到燕麦米酒的最佳发酵工艺条件为：酵母菌接种量0.14%，发酵温度30.7 ℃，发酵时间4.6 d，燕麦汁添加量21.02%。在此条件下，感官评分预测值为88.17分。为便于实际操作，将最优发酵工艺条件修正为酵母菌接种量0.15%，发酵温度31 ℃，发酵时间4.5 d，燕麦汁添加量21%，在此优化条件下进行3次平行验证试验，得到燕麦米酒的感官评分实际值为（89±1）分，与模型预测基本吻合。

2.4 燕麦米酒抗氧化活性研究

多酚作为米酒中较为常见的抗氧化活性物质，可清除自由基，具有抗炎、抗糖尿病等多种健康功效[30]。以纯糯米米酒为对照，测定燕麦米酒DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率以及铁原子还原能力，结果见图7。

图7 燕麦米酒的DPPH（a）、ABTS（b）自由基清除率及铁原子还原/抗氧化能力（c）Fig.7 DPPH (a), ABTS (b) radicals scavenging rate and ferric ion reducing/antioxidant power (c) of oat rice wine

由图7a和图7b可知，当米酒添加量为1.2 mL时，燕麦米酒和纯糯米酒的DPPH自由基清除率分别为55.20%和51.02%，ABTS自由基清除率分别为85.29%和65.21%，即燕麦米酒的DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力分别是纯糯米酒的1.08倍、1.31倍。由图7c可知，燕麦米酒铁离子还原能力显著高于纯糯米酒（P＜0.05），当米酒添加量为1.8 mL时，燕麦米酒的FRAP值为0.61 mmol/L，是纯糯米酒FRAP值（0.36 mmol/L）的1.69倍。结果表明，燕麦米酒的抗氧化能力优于纯糯米米酒。

2.5 燕麦米酒的理化指标

通过理化指标的测定发现，燕麦米酒的酒精度为8.00%vol，还原糖含量为37.40 g/L，总酸含量为5.92 g/L，非糖固形物含量为13.70 g/L，同时总多酚含量达到0.69 g/L，其各项理化指标均符合NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》的要求。

3 结论

本研究通过改变燕麦原料使用方法，将燕麦进行酶解处理后加入甜酒糟参与酒精发酵，比燕麦仁半固态发酵出酒率提高40.6%。在此基础上，通过单因素及响应面试验确定了燕麦米酒最佳发酵条件为发酵时间4.5 d、燕麦汁添加量21%、酵母菌接种量0.15%，发酵温度31 ℃。在此条件下所得的燕麦米酒质地均一，口感醇和，风味俱佳，具有独特的燕麦香，感官评分为89分，酒精度为8.00%vol，还原糖含量为37.40 g/L，总酸含量为5.92 g/L，非糖固形物含量为13.70 g/L，总多酚含量为0.69 g/L，其各项理化指标均符合NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》的要求。抗氧化研究结果表明，燕麦米酒1,1二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除率，铁离子还原能力（FRAP）分别为纯糯米酒的1.08倍、1.31倍、1.69倍，其抗氧化能力优于纯糯米酒。