在线固相萃取-高效液相色谱法快速测定果汁中的苯并咪唑类残留量

◎ 何瑞雪，彭 芸，游 靖，何 玥，曾 玮

（1.珠海市食品药品检验所，广东 珠海 519000；2.安捷伦科技（中国）有限公司，广东 广州 510000）

多菌灵、甲基硫菌灵和噻苯达唑是常见的苯并咪唑类杀菌剂，具有高效性和广谱性，常用于果蔬的病虫害防治[1-3]。这些物质在美国、加拿大、欧盟等国家和地区已被禁止在食品中使用，但我国并未禁止使用，《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）给出了这3 种物质在各类食品中的最大残留限量。

目前有多种方法对果蔬中多菌灵、甲基硫菌灵和噻苯达唑残留物进行分析，包括表面增强拉曼散射法[4]、荧光光谱法[5]、高效液相色谱法[6]、液相色谱-串联质谱法[7]等。为了降低基质效应，农药残留物的检测往往需要一定的前处理方法。常用的前处理方法有液液萃取[8]、传统固相萃取[9]、分散固相萃取[10]、在线固相萃取[11-12]等。液液萃取溶剂消耗量大，传统固相萃取样品量需求大，而在线固相萃取样品消耗小且可以重复使用吸附剂，可以实现自动化和低成本的工作流程[13]。

本研究通过高效液相色谱仪搭载在线固相萃取装置，建立了检测果汁中多菌灵、甲基硫菌灵和噻苯哒唑含量的方法。本方法节省了样品前处理时间和前处理所需的试剂与耗材，无须用到液质联用仪即可达到质谱检测的灵敏度，节省了仪器成本。此外，萃取小柱经在线活化后可反复使用，解决了离线固相萃取处理耗时长、成本高的问题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

多菌灵标准物质，1 000 μg·mL-1，含量≥99%，北京坛墨质检科技有限公司；甲基硫菌灵标准物质，1 000 μg·mL-1， 含量≥99%，First Standard； 噻苯哒唑标准物质，1 000 μg·mL-1，含量≥99%，First Standard；乙腈、甲醇，色谱纯；实验室用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

安捷伦1260 infinity Ⅱ在线固相萃取-液相色谱仪，二极管阵列检测器，10 mm 流量池，荧光检测器，美国安捷伦公司；SIGMA 3K15离心机，曦玛离心机（扬州）有限公司；milli-Q IQ 7000 超纯水系统，德国默克密理博公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Poroshell HPH C18（100 mm×4.5 mm，2.7 μm）； 萃取柱：PLRP-S（4.6 mm×12.5 mm，15 ～20 μm）；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；上样泵流动相：水-甲醇；分析泵流动相：水-甲醇；流速：0.5 mL·min-1；切阀时间：5.0 min 萃取柱切换到二维，6.5 min 萃取柱切换到一维；二极管阵列检测波长：280 nm；荧光检测波长：激发波长280 nm、发射波长315 nm；运行时间：20 min；后运行时间：2 min。上样泵梯度：0 ～2 min，20%甲醇；2 ～6 min，甲醇20% →90%；6 ～10 min， 甲醇90% →100%；10 ～16.5 min， 甲醇100%；16.5 ～16.6 min， 甲醇100% →20%。 分析泵梯度：0 ～5 min，15%甲醇；5 ～9 min，甲醇15% →50%；9 ～13 min，甲醇50%→100%；13 ～15 min，甲醇100%；15 ～18 min，甲醇100%→15%。

1.3.2 在线固相萃取-高效液相色谱分析流程

在线固相萃取过程主要包括活化、进样、净化、反冲、分析5 个过程。样品组分由进样器引入在线固相萃取柱上纯化和富集，干扰物则从柱上流出并排至废液中，分析柱处于清洗和平衡的状态；切换六通阀后，分析泵流动相将目标化合物从在线固相萃取柱上反冲到分析柱上，此时在线固相萃取柱和分析柱形成串联通路；待目标化合物全部转移后，再次切换六通阀，使在线固相萃取柱和分析柱处于分离状态，目标化合物在分析柱上进行分离和定量分析，在线固相萃取柱则进行清洗和平衡过程，等待下一次进样。

1.3.3 标准溶液的配制

标准储备液配制：准确移取多菌灵标准物质（1 000 μg·mL-1）、噻苯哒唑标准物质（1 000 μg·mL-1）、甲基硫菌灵标准物质（1 000 μg·mL-1）各100 μL 到10 mL 棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，-20 ℃冰箱避光保存，该混合标准储备液浓度为10 μg·mL-1。

系列标准工作液配制：准确移取混合标准储备液（10 μg·mL-1）0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL 和2.00 mL 到10 mL 棕色容量瓶中，移取1 μg·mL-1的标准溶液0.05 mL、0.10 mL 到10 mL 棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，-20 ℃冰箱避光保存，分别配成系列1混合标准工作液浓度为0.005 μg·mL-1、0.050 μg·mL-1、0.100 μg·mL-1、0.200 μg·mL-1、0.500 μg·mL-1、1.000 μg·mL-1和2.000 μg·mL-1；系列2 混合标准工作液浓度为0.01 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1和2.00 μg·mL-1。

1.3.4 样品前处理

果汁样品经过9 000 r·min-1离心5 min，过0.22 μm微孔滤膜后，进高效液相色谱仪测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 上样泵流动相及梯度选择

上样泵的主要作用是纯化和富集目标化合物，在洗脱过程中能尽快使目标化合物洗脱至分析柱中，同时又不影响目标化合物在分析柱上的分离。为确定上样泵的条件，在不接分析泵和分析色谱柱的情况下，标准物质进样后直接洗脱至检测器检测。PLRP-S 在线固相萃取小柱采用聚合物型反相吸附剂，支持逆流，适用范围广，通过实验考察了甲醇、水作为上样流动相时3 种化合物的保留情况。结果显示，多菌灵、甲基硫菌灵以及噻苯哒唑均能有效保留，洗脱过程采用高比例甲醇进行洗脱，3 种农药均能在1.5 min 内有效洗脱，由此确定洗脱至分析柱过程的切阀时间，完成分析后在线固相萃取小柱进行清洗和平衡过程，等待下一次进样。

2.1.2 分析泵流动相及梯度选择

为使多菌灵、甲基硫菌灵以及噻苯哒唑3 种物质达到良好的分离效率，采用3 种物质的单标和混合标准工作液对分析泵参数进行优化。分别采用水、体积分数0.1%磷酸水溶液、离子对试剂（吸取7.00 mL磷酸于100 mL 水中，加入1.0 g 辛烷磺酸钠，溶解，加入10.00 mL 三乙胺，加水定容至1 000 mL）、0.02 mol·L-1乙酸铵水溶液、0.02 mol·L-1乙酸铵水溶液（加入体积分数0.1%甲酸）作为水相，甲醇和乙腈作为有机相，考察流动相对色谱分离效率的影响。结果表明，离子对试剂、0.02 mol·L-1乙酸铵水溶液作为流动相，3 种物质均不出峰；在0.02 mol·L-1乙酸铵水溶液的基础上加入体积分数0.1%的甲酸，3 种物质可出峰但色谱峰峰形宽；体积分数0.1%磷酸水溶液作为流动相体系，3 种物质可出峰，峰形对称，但混标多菌灵和甲基硫菌灵峰形重叠，调整流动相梯度均不能使多菌灵与甲基硫菌灵有效分离；水-乙腈作为流动相体系，3 种物质均不出峰；水-甲醇作为流动相体系，3 种物质可出峰，峰形窄且对称，且能达到较为理想的色谱分离效果，因此选择水和甲醇作为分析泵流动相。

2.1.3 检测器参数的优化

在相同的色谱条件下，采用3 种物质的单标和混合标准工作液对检测器参数进行优化。采用二极管阵列检测器于200 ～800 nm 波长下扫描，发现3 种物质在280 nm 处吸收强度较大，因此选择该波长进行检测。采用荧光检测器固定发射波长进行多激发波长检测，以及固定激发波长进行多发射波长检测的方法，得到激发波长280 nm、发射波长315 nm 的检测条件，但甲基硫菌灵在荧光检测器上无响应，色谱图见图1、图2。

1—多菌灵；2—噻苯哒唑；3—甲基硫菌灵。图1 3 种化合物的色谱图（二极管阵列检测器）

2.2 线性范围和检测限

由表1和表2可知，采用二极管阵列检测器，多菌灵、甲基硫菌灵以及噻苯哒唑在0.01 ～2.00 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好，检出限均为0.01 μg·mL-1；采用荧光检测器，多菌灵以及噻苯哒唑在0.005 ～2.000 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好，检出限均为0.005 μg·mL-1，在荧光检测器上可得到更高的响应值和更低的检出限。

表1 3 种化合物的线性关系、检出限表（二极管阵列检测器）

表2 2 种化合物的线性关系、检出限表（荧光检测器）

2.3 回收率与精密度

采用加标回收实验来验证方法的准确性，在样品中分别加入4 个浓度水平的待测物，每个水平重复6 次，计算加标回收率及相对标准偏差，结果见表3和表4。采用二极管阵列检测器，在苹果汁和梨汁基质中，加标回收率在89.4%～106.9%，相对标准偏差在0.3%～4.5%；采用荧光检测器，在苹果汁和梨汁基质中，加标回收率在94.5%～101.6%，相对标准偏差在0.2%～5.4%，回收率和精密度均符合化学分析方法的要求。

表3 二极管阵列检测器检测苹果汁和梨汁中3 种化合物的回收率和精密度表（n=6）

表4 荧光检测器检测苹果汁和梨汁中2 种化合物的回收率和精密度表（n=6）

3 结论

本研究建立了在线固相萃取-高效液相色谱法快速测定果汁中的多菌灵、甲基硫菌灵和噻苯哒唑残留量分析方法，样品经高速离心处理，直接进高效液相色谱仪，采用以聚合物为填料的PLRP-S 萃取柱进行净化和富集后，切换六通阀使目标物进入C18分析柱分离，采用甲醇-水为流动相，进行梯度洗脱，分别用二极管阵列检测器检测和荧光检测器检测。样品提取步骤是整个检测中至关重要的一环，影响着实验的准确性和精密度，该方法样品无须复杂的前处理，净化和富集过程完全由液相色谱仪在线固相萃取系统自动完成，与传统前处理方法相比，不仅避免了离线固相萃取前处理过程中复杂烦琐的步骤，减少了提取步骤中由人为因素导致回收率偏低和重复性差的情况，而且试剂消耗量小，降低了检测的经济成本，提高了检测的效益，为果汁中多菌灵、甲基硫菌灵和噻苯哒唑残留量的检测提供技术支持，也可为其他药物的快速检测提供参考依据。