不同处方美沙拉秦（嗪）肠溶片中相关杂质的分析

吴琦琦，刘轶，周明，李帅，李晓燕，刘雁鸣，文亮（湖南省药品检验检测研究院，长沙 410001）

美沙拉秦（嗪），化学名为5-氨基-2-羟基苯甲酸[1-2]，是临床治疗溃疡性结肠炎和克罗恩病的一线药物[3-4]。由瑞典PharmaciaAB公司开发，于英国TillotsLabs公司1985年首次上市。目前国内共有3家企业生产。本品已知杂质共有16种[5]，大多含有硝基苯或氨基苯结构片段，具有潜在的基因毒性。通过基因毒性预测软件Derek和Sarah分析，其杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质I、杂质J、杂质M、杂质N、杂质S均为阳性，其中杂质A为对氨基酚，因可诱导DNA的断裂而具有明确的遗传毒性。《欧洲药典》对这些杂质进行了严格的控制；而国内现行质量标准有3个，部分标准缺失有关物质项，部分标准杂质检出能力差，可能会存在质量风险。溃疡性结肠炎和克罗恩病根治困难、易反复发作，一旦患病，往往需要长期服药[6]。因此，亟须对其首选药物——美沙拉秦（嗪）肠溶片上市后的安全性、有效性及质量可控性进行相关的评价性研究[7]。

1 仪器与试药

Agilent1260高效液相色谱仪、Agilent 1260 2D-6120二维液质联用仪（美国安捷伦公司）；梅特勒托利多V20水分测定仪（瑞士梅特勒托利多公司）；瑞士万通XP205电子天平（精度0.01 mg）。

美沙拉秦（嗪）肠溶片：企业1（51批次样品）、企业2（32批次样品）、企业3（32批次样品）；甲醇为色谱纯，磷酸氢二钾、10%四丁基氢氧化铵水溶液为分析纯，水为纯化水。

2 方法

2.1 液相色谱条件

色谱柱为Agilent1 C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相A为磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钾4.35 g，加水溶解并稀释至1000 mL，用磷酸调pH值至7.2）-TBAH溶液[取10%四丁基氢氧化铵水溶液80 mL，加水稀释至200 mL，用硫酸溶液（1→2）调节pH值至7.5]-甲醇-水（250∶50∶100∶600）；流动相B为磷酸盐缓冲液-TBAH溶液-甲醇-水（250∶50∶500∶200），按表1梯度洗脱，流速为1.0 mL·min－1；柱温为40℃；检测波长为240 nm；进样量为10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution

2.2 质谱参数

采用ESI离子源、正离子及负离子全扫描模式，m/z范围为70～1000，扫描时间0.2 s，喷雾电压2.5 kV，去溶剂温度500℃，去溶剂气体800 L·h－1。

2.3 溶液的制备

取供试品10片，研细，精密称取细粉适量（约相当于美沙拉秦40 mg），置100 mL量瓶中，加甲醇20 mL和0.2 mol·L－1磷酸二氢钠溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液0.5 mL，置500 mL量瓶中，用0.2 mol·L－1磷酸二氢钠溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。临用时新制。

3 结果

3.1 杂质谱

采用“2.1”项下条件对115批美沙拉秦（嗪）肠溶片样品进行了分析，结果如图1所示。主要检出4种杂质，杂质3为欧洲药典中杂质G，3家企业样品均有检出，其余为未知杂质，且均为企业1生产的样品特有。各杂质含量测定结果如表2所示。

图1 美沙拉秦（嗪）肠溶片杂质谱Fig 1 Impurity spectrum of mesalazine enteric-coated tablets

表2 各杂质含量测定结果(%)Tab 2 Content of impurities (%)

3.2 杂质1、杂质2来源分析

首先考虑是否为原辅料引入。各企业所用原辅料如表3所示。将企业1所用原辅料分别采用“2.1”项下条件测定，结果如图2所示，均无该3个杂质峰，证明不是原辅料直接引入。

图2 企业1原辅料色谱图Fig 2 API and excipients chromatograms of enterprise 1

表3 美沙拉秦(嗪)肠溶片处方Tab 3 Prescription of mesalazine enteric-coated tablets

从该企业的留样库里调取了5批留样（均为本次研究涉及的批次），采用“2.1”项下条件进样测定，结果与市售样品一致。提示该杂质可能在出厂时已经存在，不由储存产生。

取处方量的原辅料进行压片前工艺的模拟，分别于原辅料混合、制粒、60℃干燥3 h 3个步骤取样测试。结果如图3所示，从原辅料混合后，杂质1就开始出现，并在制粒、干燥后该杂质逐渐增多。

图3 企业1制粒过程样品色谱图Fig 3 Chromatogram of sample pelletizing process from enterprise 1

对比3家企业所用辅料，发现乳糖、微晶纤维素和滑石粉是企业1所特有，分析乳糖的结构发现，乳糖是由葡萄糖及半乳糖所组成的双糖，即由葡萄糖的第四个碳原子上的羟基与半乳糖中第一个碳原子的β-半缩醛羟基失水成苷键而得。因此仍然保持着葡萄糖分子上所含醛基的还原性。如图4所示，美沙拉秦结构中含有伯胺基，在加热的条件下能与还原糖发生羰氨反应（Maillard反应），氨基与羰基缩合生成席夫碱。温度20～25℃即可发生Maillard反应，一般每相差10℃，反应速度相差3～5倍，30℃以上速度加快，高于80℃时，反应速度受温度和氧气影响小。水分含量在10%～15%时，反应易发生。该企业工艺参数显示，本品为湿法制粒，干燥温度为60℃，均利于Maillard反应的发生。

图4 乳糖与美沙拉秦的反应Fig 4 Reaction of lactose with mesalazine

用“2.2”项下方法测试杂质1的分子量，如图5所示，在负离子模式下，分子离子峰质荷比为476，正离子模式下，分子离子峰的质荷比为478，证明该杂质的分子量为477。乳糖的分子量为342，美沙拉秦的分子量为153，两者缩合脱水后的分子量恰好就是477。杂质2与杂质1质荷比相同，可能为杂质1的异构体。

图5 杂质1质谱图Fig 5 Mass spectrum of impurity 1

综上所述，杂质1可能为辅料乳糖与美沙拉秦原料在生产过程中发生了Mailard而产生的。

3.3 杂质4来源分析

与同企业未检出杂质4批次的样品比较，检出杂质4的样品除去包衣后的片芯颜色都偏深，且片子硬度偏软，其水分分别为3.24%与3.41%。于企业1留样库里调取了同批次的留样进行测定，结果如表4所示。从企业留样库里调取的同样批次的样品均未检出杂质4，片芯颜色均显类白色，且片子硬度较大，水分值分别为1.94%与2.08%。提示样品在流通储存过程中发生了变化（硬度变小，水分增加），该杂质可能于流通储存环节中产生。

表4 不同来源美沙拉秦样品中杂质4的检测情况Tab 4 Detection of impurity 4 in mesalazine samples from different sources

将美沙拉秦原料及3个企业的样品分别进行高温、高湿、光照、高温＋高湿四种条件的影响因素试验，结果如表5所示。在单独的光照、高温及高湿的条件下，本品的性状及杂质4没有改变，但在高温及高湿的共同作用下，企业1样品的性状发生了改变，同时产生了杂质4（见图6）。企业2及企业3样品的性状均未发生改变，也未产生杂质4。

图6 企业1杂质色谱图Fig 6 Impurity chromatogram of enterprise 1

表5 各因素对不同来源美沙拉秦样品中杂质4的影响Tab 5 Effect of various factors on impurity 4 in mesalazine samples from different sources

分析各企业处方发现，企业1使用了辅料微晶纤维素。微晶纤维素吸湿性强，在高湿度下会吸湿增加水分，水分作为反应介质，增加了系统的塑性和分子流动性，同时形成水膜，反应就在此发生，进一步引起美沙拉秦降解，杂质显著增加。

企业2和企业3的处方未使用微晶纤维素，其样品比较稳定，高温高湿放置7 d后，性状未发生变化，杂质未见增加。

用LC-MS测试杂质4的分子量，结果如图7所示，负离子模式下，分子离子峰质荷比为260；正离子模式下，分子离子峰的质荷比为262。证明该杂质的分子量为261。

图7 杂质4质谱图Fig 7 Mass spectrum of impurity 4

根据其分子量初步推测，杂质4的结构可能为图8所示。具体情况还有待进一步研究证实。

图8 杂质4可能的结构图Fig 8 Possible structure of impurity 4

4 讨论

4.1 不同处方的样品杂质谱有较大差异

本文对市售各企业多批样品进行了有关物质考察，共检出4个主要杂质，其中杂质1、杂质2和杂质4为企业1生产的样品的特有杂质，杂质3为所有样品的共有杂质。提示不同处方的样品杂质谱有较大差异。

4.2 企业1处方不合理，应对其进行变更

杂质1、杂质2为企业1处方中辅料与原料发生反应产生的，同时，企业1处方中的辅料还可能会促进杂质4的生成。提示企业1处方不合理，应对其进行变更。

4.3 原辅料相容性应引起重视

《药用辅料与药物相容性研究指导原则》指出：药物制剂中各种药用辅料、药用辅料的杂质及药物活性成分之间不得发生化学反应，不产生新化学成分或杂质，进而不影响药物的疗效。乳糖与美沙拉秦会产生Maillard反应，生成杂质，含美沙拉秦的制剂中应避免使用乳糖作为辅料。

微晶纤维素吸湿性强，在高湿度下会吸湿增加水分，可能会引起美沙拉秦降解速率的增大，使制剂杂质显著增加，含美沙拉秦的制剂中也应避免使用微晶纤维素作为辅料。

4.4 小结

本文对目前市售的不同处方的美沙拉秦（嗪）肠溶片的杂质进行全面分析，通过建立新的杂质检测方法及杂质谱，从杂质种类、杂质个数、杂质来源、不同处方样品的稳定性等方面进行分析，从而对其产品质量及生产工艺进行评价，同时，使各企业对自身产品质量状况、同品种质量现状以及产品质量改进等各方面有客观的认识和了解，为药品监督管理部门今后对美沙拉秦（嗪）肠溶片的监督管理提供了参考。