蒙药角茴香配方颗粒指纹图谱及含量测定研究

韩子璇，刘梦，杨立茹，李佳，康廷国*，张纯刚，2，3*（.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 6620；2.长治医学院药学系，山西 长治 046000；3.祈蒙股份有限公司，内蒙古 赤峰 024330）

蒙药材角茴香是蒙医常用药材，为罂粟科植物直立角茴香（或细叶角茴香）HypecoumerectumL.的干燥全草，别名咽喉草、山黄连等，主产于内蒙古、河北、辽宁等地[1-2]。角茴香具有解毒、解热、止痛等功效，含有生物碱类、黄酮类、糖类、酸类、微量元素等多种化学成分，其中的生物碱类成分具有抗炎、抗菌、镇痛、保肝等药理作用，是角茴香的主要活性成分[3-5]。

蒙医药的理论基础独特，在剂型方面多以散剂、丸剂为主，而且在许多药方、制剂中习惯性采用原粉入药，导致蒙药制剂服用口感差，患者依从性差。本课题组在前期研究中成功制备了角茴香配方颗粒，改善了原散剂的适口性，便于临床调配。经过实验室初步验证及试验生产，证实该颗粒符合蒙药制剂企业的制剂需要与生产要求。

通过对角茴香药材和相关制剂的质量标准及有关文献进行调研发现，目前角茴香药材收录于2020版《内蒙古蒙药饮片炮制规范》，并规定HPLC法测定药材中原阿片碱的含量不得少于0.3%[1]；文献涉及有对角茴香中生物碱、黄酮类成分的提取、含量测定及指纹图谱的研究，但文献数量较少，且内容不全，更无关于角茴香配方颗粒的研究[6-9]。为更好地对蒙药角茴香配方颗粒进行质量控制，本研究建立蒙药角茴香配方颗粒的HPLC指纹图谱，并在此基础上对指纹图谱指认的3种化学成分进行含量测定，以期为蒙药角茴香配方颗粒的质量控制及蒙药新剂型的发展提供参考。

1 仪器与试药

1.1 试药

15批直立角茴香药材细粉（批号：YL2022201、YL2022301、YL2022302、YL2022401～YL2022404、YL2022501～YL2022503、YL2022601～YL2022604、YL2022701，产地：祈蒙股份有限公司）；芦丁（批号：100080-202012，纯度：91.6%）、原阿片碱（批号：110853-201805，纯度：99.6%）（中国食品药品检定研究院）；黄连碱对照品（批号：F1111AS，纯度＞98.0%，大连美仑生物技术有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；乙腈（色谱纯，瑞典欧森巴克化学公司）；甲醇、乙酸铵（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；冰醋酸、盐酸（分析纯，上海润捷化学试剂有限公司）。

1.2 仪器

Y-2摇摆制粒机（上海天和制药机械有限公司）；SG3300H超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；CP225D十万分之一电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；LC-1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，包括四元泵，VWD可变波长扫描紫外检测器，Chemstations化学工作站）。

2 方法与结果

2.1 角茴香配方颗粒的制备

分别取15批过100目筛的角茴香药材细粉各200.0 g，加入适量辅料混合均匀，再加入适量水为润湿剂，用手不断揉捏混匀得到“手握成团，轻压即散”状态的软材，通过摇摆制粒机制粒（14目筛网），收集所得颗粒，60℃下烘干。按照2020年版《中国药典》四部通则0982双筛分法整粒（能通过一号筛但不能通过五号筛），包装，得到15批蒙药角茴香配方颗粒，均符合制药企业生产要求，批号为JHXPFKL-1～JHXPFKL-15。

2.2 色谱条件

采用COSMOSIL 5C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈（A）-0.1 mol·L－1乙酸铵（含0.05%冰醋酸）（B）为流动相，梯度洗脱（0～5 min，5%～6%A；5～15 min，6%～11.5%A；15～20 min，11.5%A；20～25 min，11.5%～17.5%A；25～30 min，17.5%A；30～35 min，17.5%～ 20%A；35～45 min，20%A；45～50 min，20%～ 25%A；50～55 min，25%A；55～60 min，25%～ 30%A；60～65 min，30%～5%A）；流速1.0 mL·min－1；柱温28℃；检测波长300 nm；进样量10 μL。

2.3 供试品溶液的制备

取蒙药角茴香配方颗粒样品，研细，精密称定0.200 g，置于10 mL量瓶中，加入适量甲醇-1%盐酸溶液（50∶50），超声提取（100 W，40 kHz）30 min，放至室温后定容至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得[10]。

2.4 对照品溶液的制备

精密称取适量芦丁、原阿片碱、黄连碱对照品分别置于10 mL量瓶中，用甲醇-1%盐酸溶液（50∶50）超声溶解，放至室温后定容至刻度，分别得到质量浓度为0.181、0.366、0.165 mg·mL－1的芦丁、原阿片碱、黄连碱对照品储备液。精密移取各储备液适量于10 mL量瓶中，用甲醇-1%盐酸溶液（50∶50）稀释定容至刻度，配制成质量浓度分别为54.28、183.14、16.45 μg·mL－1的混合对照品溶液。其中，芦丁校正质量浓度为49.72 μg·mL－1。

2.5 角茴香配方颗粒HPLC指纹图谱的建立

2.5.1 精密度试验 取同一份供试品溶液（批号：JHXPFKL-1），在“2.2”项色谱条件下连续进样6次，记录色谱图，以13号峰（原阿片碱）为参照峰，计算18个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果各共有峰的相对保留时间RSD值均＜0.79%，相对峰面积RSD值均＜1.2%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 取同一批角茴香配方颗粒（批号：JHXPFKL-1）6份，每份0.200 g，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进行分析测定，记录色谱图，以13号峰（原阿片碱）为参照峰，计算18个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果各共有峰的相对保留时间的RSD值均＜0.82%，相对峰面积的RSD值均＜1.5%，表明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号：JHXPFKL-1），按“2.2”项下色谱条件分别于第0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录色谱图，以13号峰（原阿片碱）为参照峰，计算18个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果各共有峰的相对保留时间RSD值均＜0.91%，相对峰面积的RSD值均＜3.4%，表明角茴香配方颗粒供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.4 指纹图谱的建立 取15批角茴香配方颗粒（JHXPFKL-1～JHXPFKL-15），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按照“2.2”项下色谱条件进样分析，得到指纹图谱见图1。

图1 角茴香配方颗粒（S1）和混合对照品（S2）指纹图谱Fig 1 HPLC fingerprint of hypecoum formula granules（S1）and mixed reference substances（S2）

2.5.5 共有峰标记 以原阿片碱作为参考峰，标定了18个共有峰，其中11号峰是芦丁，13号峰是原阿片碱，16号峰是黄连碱，角茴香配方颗粒及混合对照品HPLC指纹图谱见图1。以13号峰（原阿片碱）为参照峰，18个共有峰相对保留时间的RSD均＜0.49%，相对峰面积的RSD在2.9%～28.3%。表明不同批次的角茴香配方颗粒化学成分种类相似，但成分含量存在一定差异。

2.5.6 相似度计算 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版，导入15批角茴香配方颗粒的图谱数据，采用“平均数”法生成对照图谱R，经多点校正、色谱峰匹配，得到15批角茴香配方颗粒的色谱图见图2。以对照图谱R为参照，15批角茴香配方颗粒的相似度均在0.982以上，相似度见表 1。反映角茴香配方颗粒化学成分组成基本一致，整体质量相对稳定，符合指纹图谱研究要求。

表1 15批角茴香配方颗粒指纹图谱相似度Tab 1 Fingerprint similarity of 15 batches of hypecoum formula granules

图2 15批角茴香配方颗粒HPLC叠加指纹图谱Fig 2 HPLC overlapp fingerprint of 15 batches of hypecoum formula granules

2.6 角茴香配方颗粒有效成分的含量测定

2.6.1 专属性考察 取空白溶剂（甲醇-1%盐酸溶液（50∶50）、混合对照品溶液、角茴香配方颗粒供试品溶液（批号：JHXPFKL-1）适量，按“2.2”项下色谱条件进样测定，结果见图3。角茴香配方颗粒供试品与芦丁、原阿片碱、黄连碱对照品在相同保留时间有相同色谱峰且分离度良好，空白溶剂在供试品及对照品色谱峰的保留时间处无干扰，说明该方法专属性较好。

图3 空白溶剂（A）、混合对照品溶液（B）、角茴香配方颗粒供试品（C）HPLC色谱图Fig 3 HPLC chromatogram of blank solvent（A），mixed reference substances（B），and sample of hypecoum formula granules（C）

2.6.2 线性关系考察 精密吸取“2.4”项下混合对照品溶液适量，逐级稀释并定容摇匀，得到含芦丁（按校正质量浓度记）13.03、16.30、20.36、25.46、31.82、39.77、49.72 μg·mL－1，原阿片碱48.01、60.01、75.01、93.77、117.21、146.51、183.14 μg·mL－1，黄连碱3.45、4.31、5.39、6.74、8.43、10.53、16.45 μg·mL－1系列浓度的混合对照品溶液。依照“2.2”项下色谱条件进样，测定芦丁、原阿片碱、黄连碱的峰面积。分别以3种对照品的质量浓度X（μg·mL－1）和峰面积Y绘制回归曲线，得回归方程如表2所示[10]。

表2 各成分线性关系考察结果Tab 2 Linearity of each component

2.6.3 精密度试验 取同一份角茴香配方颗粒供试品溶液（批号：JHXPFKL-1），依照“2.2”项下色谱方法连续进样6次，记录芦丁、原阿片碱、黄连碱峰面积，结果RSD值分别为0.49%、0.15%、0.81%，表明仪器精密度良好。

2.6.4 重复性试验 取同一批角茴香配方颗粒（批号：JHXPFKL-1）6份，每份0.200 g，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样测定，计算芦丁、原阿片碱、黄连碱平均含量分别为0.15%、0.54%、0.05%，RSD值分别为0.22%、0.56%、0.90%，表明该方法重复性良好。

2.6.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号：JHXPFKL-1），分别于第0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录芦丁、原阿片碱、黄连碱峰面积，结果RSD值分别为0.72%、0.41%、0.95%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.6 加样回收试验[11]精密称取6份已知含量的角茴香配方颗粒（批号：JHXPFKL-1），每份0.100 g。按供试品中指标成分量与加入对照品量之比1∶1原则，分别在每份样品颗粒中加入适量的芦丁、原阿片碱、黄连碱对照品。按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液进样测定，计算3种成分的加样回收率。结果显示，芦丁、原阿片碱、黄连碱的平均加样回收率分别为101.57%、107.44%、101.44%，RSD值分别为0.78%、0.96%、1.7%，表明该方法回收率良好。

2.6.7 样品含量测定 取15批角茴香配方颗粒，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，分别计算芦丁、原阿片碱、黄连碱的含量，结果见表3。15批角茴香配方颗粒中芦丁的含量为0.12%～0.23%、原阿片碱的含量为0.50%～0.54%、黄连碱的含量为0.04%～0.05%，表明各批次颗粒间3种成分含量有一定差异，但整体含量较稳定。

表3 15批角茴香配方颗粒中3种成分的含量测定结果Tab 3 Content of 3 chemical ingredients in 15 batches of hypecoum formula granules

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

本课题组在前期研究中分别对乙腈-1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%醋酸（三乙胺调pH 5.0）、甲醇-0.3%三乙胺、乙腈-0.1 mol·L－1乙酸铵、乙腈-0.1 mol·L－1乙酸铵（含0.05%冰醋酸）作为流动相进行考察，发现采用乙腈-0.1 mol·L－1乙酸铵（含0.05%冰醋酸）作为流动相时色谱峰较多、分离度较好且基线稳定，故选用此流动体系。同时，对不同温度（25、28、30℃）、不同检测波长（280、289、300 nm）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL·min－1）等条件进行考察。结果不同温度条件下，出峰时间与各峰之间分离度有一定差异，25、30℃条件下存在部分色谱峰峰高不明显或分离度不够的情况，故选择柱温为28℃。检测波长为300 nm时，指纹图谱整体峰高比例较好且溶剂峰影响较小，故选择检测波长为300 nm。

3.2 指纹图谱的建立及含量测定结果分析

指纹图谱技术兼具模糊性、整体性与差异性，可在成分不明确的情况下区分药材种属、反映药材整体质量，适用于成分复杂或对照品不足的中药及中药制剂的质量研究[12]。角茴香作为一种天然药物，物质基础复杂，仅采用单一指标很难综合考察其质量。因此本研究建立角茴香配方颗粒指纹图谱，并对其中有效成分含量进行测定，更加科学、全面地考察角茴香配方颗粒的质量。

生物碱是角茴香的主要药效成分，其中的原阿片碱具有镇痛、抗炎的药理作用。黄酮类是角茴香中除生物碱外的另一主要化学成分，因此，在指认原阿片碱、黄连碱的基础上，增加黄酮类成分芦丁色谱峰的指认，并对3种有效成分进行含量测定，可更加完善对蒙药角茴香配方颗粒的化学表征。建立的蒙药材角茴香配方颗粒指纹图谱及含量测定结果显示，制备的15批角茴香配方颗粒质量稳定，符合质量要求，可为后续角茴香药材及制剂的质量研究提供参考。