UPLC-Q-TOF-MS/MS法快速鉴定加味八珍益母膏化学成分

王英力，杨欣欣，2，3，李天娇，2，3，王帅，2，3*，包永睿，2，3*，孟宪生，2，3（.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 6600；2.辽宁省中药多维分析专业技术创新中心，辽宁 大连 6600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 6600）

加味八珍益母膏来自满药“加味八珍益母汤”，由满族的益母草膏和清宫秘方八珍汤再结合桃仁、丹参、红花等几味活血药组成[1]。具有补气养血、祛瘀调经的功效，能够较好地改善患者盆腔循环功能，调节卵巢功能，增加子宫内膜厚度，且无肝肾毒性[2-3]，临床上常被用于治疗宫寒、痛经等疾病[4]。目前关于加味八珍益母研究的相关文献多为临床治疗、症候分型等方面，关于化学成分分析及质量控制的文献较少，且《中国药典》中相关质量控制为采用高效液相色谱法测定其中1个成分。加味八珍益母膏由15味药材加工而成，仅对其中的1～2个成分进行含量测定的质量控制具有一定片面性，所以本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对加味八珍益母膏的化学成分进行快速识别，拟结合后续药效实验及质量控制方法学验证实验，确定加味八珍益母膏潜在的质量标志物，以期为加味八珍益母膏更加全面的质量控制研究提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1290 UPLC-6500 Q-TOF 色谱-质谱联用仪（配置 MassHunter 质谱工作站和 Mass analysis质谱数据处理系统）；T-124/85S型电子天平（美国康州HZ电子科技有限公司）。

1.2 试药

盐酸益母草碱（批号：111823-201202）、盐酸水苏碱（批号：110754-201111）、人参皂苷Re（批号：110754-200320）、人参皂苷Rg1（批号：110703-201530）、金丝桃苷（批号：111521-201507）、阿魏酸（批号：1107773-201915）（中国食品药品检定研究院）；异甘草苷（批号：wkq21021906）、芹菜素（批号：wkq18010301）、洋川芎内酯H（批号：wkq21012907）、咖啡酸（批号：WP22101809）、肉豆蔻酸（批号：wkq19040812）、L-苯丙氨酸（批号：wkq18070501）、丹参素（批号：WP22120203）、毛蕊花糖苷（批号：WP22101809）、美迪紫檀素（批号：wkq20070203）、绿原酸（批号：wkq23022707）（成都维克奇生物科技有限公司）；芍药苷（批号：151120，成都普菲德生物技术有限公司）。所有对照品纯度均＞98%。

加味八珍益母膏（批号：20220904，丹东药业集团有限公司，规格：150 mL/瓶）；LC-MS级甲醇、LC-MS级乙腈（德国Darmstadt公司）；LC-MS级甲酸（美国Fisher公司）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法

2.1 色谱条件

Agilent Poroshell SB-C18（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色谱柱，正离子模式：流动相0.2%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～30 min，5%～100%B；30～35 min，100%B），流速0.4 mL·min－1，柱温30℃，进样量0.5 μL。负离子模式下流动相为纯水（A）-甲醇（B），其他条件同正离子模式。

2.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离离子源，干燥气体温度：250℃，干燥气体流速：11 mL·min－1，雾化器：45 psi，鞘气温度：350℃，鞘气流量：11 mL·min－1，碎裂电压：125 V，正、负离子模式下的毛细管电压分别为4000 V、3500 V，喷嘴电压：500 V，质量范围50～1200m/z，采样频率为1 spentra/s。二级质谱碰撞电压为20 eV和40 eV。

2.3 供试品溶液的制备

量取加味八珍益母膏10 mL，置100 mL具塞锥形瓶中，加入40 mL 50%甲醇，称定质量，超声30 min（功率200 W，频率40 kHz），放冷后称重，用50%甲醇补足减失的重量，混匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液于进样瓶中。分别称取益母草、甘草、茯苓、人参、泽兰、桃仁（制）、红花、当归、熟地黄、川芎、赤芍、丹参、香附（制）、（炒）白术、炮姜粉末约2 g，置50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL 50%甲醇，称定质量，超声30 min（功率200 W，频率40 kHz），放冷后称重，用50%甲醇补足减失的重量，混匀，0.22 µm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.4 对照品溶液的制备

精密称取盐酸益母草碱3.23 mg、盐酸水苏碱2.12 mg、金丝桃苷2.56 mg、阿魏酸2.44 mg、异甘草苷2.06 mg、人参皂苷Re 2.36 mg、人参皂苷Rg12.08 mg、芹菜素3.34 mg、洋川芎内酯H 2.64 mg、芍药苷2.64 mg、咖啡酸3.36 mg、肉豆蔻酸2.62 mg、L-苯丙氨酸2.58 mg、丹参素2.68 mg、毛蕊花糖苷2.88 mg、美迪紫檀素2.52 mg、绿原酸2.32 mg，分别置于10 mL量瓶中，甲醇定容。分别吸取各对照品溶液500 μL于10 mL量瓶中，甲醇定容，配制成质量浓度分别为16.15、10.60、12.80、12.20、10.30、11.80、10.40、16.70、13.20、13.20、16.80、13.10、12.90、13.40、14.40、12.60、11.60 μg·mL－1的混合对照品溶液。

2.5 数据处理

通过TCMSP、PubChem等数据库以及文献查找的方式收集已知的加味八珍益母膏中15味药材的化学成分信息，以化合物名称、化学式以及化合物相对分子质量为基本信息通过PCDL建立加味八珍益母膏化学成分数据库。根据一级质谱信息中的保留时间，采用Target模式对加味八珍益母膏提取液成分信息进行扫描。使用MassHunter和PCDL进行了质谱数据处理，包括提取离子色谱图和计算元素组成，质量误差在10 ppm以内，根据质谱信息、保留时间结合对照品与相关文献对加味八珍益母膏中的化学成分进行鉴定。

3 结果

3.1 加味八珍益母膏中化学成分的鉴定

将加味八珍益母膏供试品溶液进行UPLC-QTOF-MS/MS分析，得到正、负离子模式下的总离子流图见图1。混合对照品正、负离子模式下的总离子流图见图2、3。通过MassHunter 质谱工作站和Mass analysis质谱数据处理系统分析各化合物可能产生的碎片信息，结合相关文献及对照品进行比对分析从而对化合物进行鉴定；同法对15味药材的供试品溶液进行分析，根据各成分的来源进行药材归属。结果共鉴定和推测出140个化学成分，正离子模式下鉴定出65个化学成分，其中益母草11个，白术（炒）2个，赤芍3个，川芎11个，丹参5个，当归7个，甘草7个，红花4个，炮姜8个，人参3个，熟地黄9个，泽兰2个，见表1[5-24]。负离子模式下鉴定出83个化学成分，其中益母草16个，白术（炒）4个，赤芍10个，川芎10个，丹参9个，当归7个，茯苓2个，甘草4个，红花14个，炮姜3个，人参5个，熟地黄14个，桃仁（制）3个，香附（制）3个，泽兰9个，见表2[5-8，10-20，24-32]。其中正、负离子模式下鉴定出的共有化学成分有8个，分别为3，4，5-三甲氧基苯甲酰胺、焦谷氨酸、梓醇、鸟苷、马钱素、烟花苷、芹菜素、脱咖啡酰基毛蕊花糖苷，且一些成分同时存在于不同药材中。

图1 加味八珍益母膏正离子（A）及负离子（B）模式下的总离子流图Fig 1 Total ion flow diagram of Jiawei Bazhen Yimu ointment in positive ion（A）and negative ion（B）mode

图2 混合对照品正离子模式下的总离子流图Fig 2 Total ion flow diagram of mixed reference in positive ion mode

图3 混合对照品负离子模式下的总离子流图Fig 3 Total ion flow diagram of mixed reference in negative ion mode

表1 正离子模式下加味八珍益母膏的化学成分解析Tab 1 Chemical components of Jiawei Bazhen Yimu ointment in the positive ion mode

续表1

表2 负离子模式下加味八珍益母膏的化学成分解析Tab 2 Chemical components of Jiawei Bazhen Yimu ointment in negative ion mode

续表2

3.2 化合物的裂解规律分析

3.2.1 有机酸及其衍生物类 有机酸类是一类具有酸性的有机化合物，在MS裂解过程中主要产生H2O、CO2、CO等碎片离子[32]，如没食子酸、苯甲酸、香荚兰酸、阿魏酸、油酸、L-苯丙氨酸、丹参素、6-姜二酮。以没食子酸为例，准分子离子峰为m/z169.0141 [M-H]－，其脱羧基后生成二级碎片离子m/z125.0214 [M-H-CO2]－。结合文献[8]报道，该碎片与没食子酸的理论裂解碎片相似度较高，推测该化合物可能为没食子酸，其可能的裂解途径见图4。

图4 没食子酸可能的质谱裂解途径Fig 4 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of gallic acid

3.2.2 黄酮类 黄酮类化合物本身具有2-苯基色原酮母核结构，在MS裂解过程中主要丢失中性的CO和H2O，或是发生RDA裂解，其中黄酮苷类化合物则更多脱掉糖基，如果化合物中存在甲氧基，则首先发生甲基丢失，然后可能会发生碳环丢失CO碎片等[33]。如7-羟基香豆素、10-姜酚、芒柄花苷、芹菜素、羟基红花黄色素A、甘草苷、山柰酚-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、山柰酚-3-O-槐糖苷、木犀草苷，以甘草苷为例，准分子离子峰为m/z417.1186[M-H]－，其产生的特征二级离子碎片m/z255.0666，135.0079分别为m/z417.1186脱掉一分子Glu后继续脱掉一分子C7H6O2产生的，即m/z255.0666[M-H-Glu]－，和m/z135.0079[M-H-Glu-C7H6O2]－，结合文献[5]报道，该碎片与甘草苷理论裂解碎片相似度较高，推测该化合物为甘草苷，其可能的裂解途径见图5。

图5 甘草苷可能的质谱裂解途径Fig 5 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of liquiritin

3.2.3 生物碱类 生物碱类化合物是一种含氮有机物，生理活性较强，主要由芳香体系组成，具有较多环系，分子结构紧密，不易裂解，在MS裂解过程一般发生在侧链或者取代基上[34]。如盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、葫芦巴碱，以盐酸水苏碱为例，准分子离子峰为m/z144.1027[M＋H]＋，其失去一分子C3H10N后生成二级碎片离子m/z84.9597[M＋H-C3H10N]＋。结合文献[6]报道及对照品比对，该碎片与盐酸水苏碱对照品的裂解规律一致，推测该化合物为盐酸水苏碱，其可能的裂解途径见图6。

图6 盐酸水苏碱可能的质谱裂解途径Fig 6 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of stachydrine hydrochloride

3.2.4 糖及糖苷类 糖及糖苷类化合物通常为羰基糖的衍生物通过糖的半缩醛（酮）羟基脱水缩合与另一种非糖物质结合的产物。C-糖苷类化合物在MS裂解过程中首先在糖元内部进行裂解，O-糖苷类化合物则通常在糖苷键位置发生裂解。如毛蕊花糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹糖甘草苷、6-羟基山柰酚-3-O-β-芸香糖-6-Oβ-D-葡萄糖苷，以毛蕊花糖苷为例，准分子离子峰为m/z623.1978[M-H]－，其产生m/z461.1397、315.1088、179.0325、161.0239的二级碎片离子，m/z461.1397为m/z623.1978[M-H]－失去一分子咖啡酰生成的，即m/z461.1397[M-H-C9H6O3]－，m/z315.1088为m/z461.1397脱掉一分子鼠李糖生成的，即m/z315.1088[M-H-C9H6O3-Rha]－，m/z179.0325为产生的咖啡酸碎片离子，m/z161.0239为咖啡酸脱一分子水生成的。结合文献[7]报道及对照品比对，该碎片与毛蕊花糖苷对照品的裂解规律一致，推测该化合物为毛蕊花糖苷，其可能的裂解途径见图7。

图7 毛蕊花糖苷可能的质谱裂解途径Fig 7 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of acteoside

3.2.5 萜类 萜类化合物由甲戊二羟酸衍生而来，其基本结构单元为异戊二烯[35]。在MS裂解过程中主要表现为脱掉取代基、糖苷键断裂、羟基脱落等。如梓醇、芍药内酯苷、马钱素、地黄苷、丹参新酮、白术内酯Ⅲ、隐丹参酮、白术内酯Ⅱ。以白术内酯Ⅲ为例，准分子离子峰为m/z247.1339 [MH]－，脱掉一分子H2O后继续脱掉一分子C4H8生成二级碎片离子分别为m/z229.0993 [M-H-H2O]－与m/z173.0233[M-H-H2O-C4H8]－，结合文献[23]报道及对照品比对，该碎片与白术内酯Ⅲ对照品的裂解规律一致，推测该化合物可能为白术内酯Ⅲ，其可能的裂解途径见图8。

图8 白术内酯Ⅲ可能的质谱裂解途径Fig 8 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of atractylolactone Ⅲ

3.2.6 其他类 加味八珍益母膏中还含有苯乙醇（苷）类、酰胺类、苯和取代衍生物等其他类化合物。以洋川芎内酯H为例，准分子离子峰为m/z247.0938[M＋Na]＋，其产生的二级碎片离子m/z201.9285为m/z247.0938[M＋Na]＋脱掉一分子H2O和一分子CO生成的，即m/z201.9285 [M＋Na-H2O-CO]＋，二级碎片离子m/z141.9709为m/z201.9285 [M＋Na-H2O-CO]＋脱掉一分子H2O和一分子C3H6生成的，即m/z141.9709[M＋Na-H2OCO-H2O-C3H6]＋，结合文献[7]报道及对照品比对，该碎片与洋川芎内酯H对照品的裂解规律一致，推测该化合物可能为洋川芎内酯H，其可能的裂解途径见图9。

图9 洋川芎内酯H可能的质谱裂解途径Fig 9 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of senkyunolide H

4 讨论

本试验通过UPLC-Q-TOF-MS/MS技术，建立加味八珍益母膏正、负离子模式下的化学轮廓谱，对其化学成分进行系统分析，共鉴定出140个化学成分，其中盐酸益母草碱、盐酸水苏碱、金丝桃苷、阿魏酸、异甘草苷、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、芹菜素、洋川芎内酯H、芍药苷、咖啡酸、肉豆蔻酸、L-苯丙氨酸、丹参素、毛蕊花糖苷、美迪紫檀素、绿原酸17种化学成分经过对照品比对，其他成分为结合相关文献分析得到。140个成分包括有机酸及其衍生物类成分48个，黄酮类成分32个，生物碱类成分4个，糖及糖苷类成分10个，萜类成分19个，其他类成分27个。有机酸及其衍生物类成分在MS裂解过程中主要脱掉H2O、CO2、CO等碎片离子。黄酮类成分在MS裂解过程中主要丢失中性的CO和H2O，其中黄酮苷类化合物则更多的是脱掉糖基。生物碱类成分分子结构紧密，不易裂解，在MS裂解过程一般发生在侧链或者取代基上。糖及糖苷类成分在MS裂解过程中首先在糖元内部进行裂解，O-糖苷类化合物则通常在糖苷键位置发生裂解。萜类成分在MS裂解过程中主要表现为脱掉取代基、糖苷键断裂、羟基脱落。

加味八珍益母膏的主要功效为补气养血、祛瘀调经，临床上常用于治疗女性经期前后及经期疾病，如气血不足或气滞血瘀引起的经期后移、痛经、头痛等疾病[3]。加味八珍益母膏中阿魏酸、丹参素、山柰酚-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷、异甘草素、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷、苍术酮可以调节体内环氧化酶（COX-2）、一氧化氮合成酶、白细胞介素（IL）-12、IL-6等蛋白与炎症因子的表达，从而发挥抗炎、镇痛的作用[36-46]；阿魏酸能够调节子宫催产素水平[36]，盐酸益母草碱、盐酸水苏碱具有抗炎的功效，能够调节子宫收缩的频率和张力，调节子宫雌二醇水平[47-48]；芍药苷对急性盆腔炎大鼠有明显抗炎作用，可减轻其子宫组织病变[45]；苍术酮能够降低醋酸致小鼠扭体反应[46]，从而发挥治疗痛经的功效；丹参素、毛蕊花糖苷、梓醇、洋川芎内酯H具有抗凝、抗血小板聚集的作用[37-38，49-50]，从而发挥活血补血的作用；丹参素、甘草苷、盐酸益母草碱、盐酸水苏碱、异甘草苷、阿魏酸、洋川芎内酯H、毛蕊花糖苷、苍术酮、梓醇具有抗炎镇痛、活血补血等功效。以上成分与加味八珍益母膏补气养血、祛瘀调经、治疗痛经的作用关系紧密，可作为其潜在的质量标志物。

本次研究对加味八珍益母膏的化学成分进行解析，共鉴定出140个化合物，其中益母草27个，白术（炒）6个，赤芍13个，川芎21个，丹参14个，当归14个，茯苓2个，甘草11个，红花18个，炮姜11个，人参8个，熟地黄23个，桃仁（制）3个，香附（制）3个。鉴定出与补气养血、祛瘀调经、治疗痛经功效相关性较大的成分，可能是加味八珍益母膏质量控制的潜在质量标志物，可为后续加味八珍益母膏的质量控制研究奠定基础。