m6A甲基化修饰在急性肾损伤中的研究进展

唐立丽 王昕宇 张杰 赵悦 李小悦

遵义医科大学第五附属（珠海）医院急诊科、重症医学科（广东珠海 519100 ）

急性肾损伤（acute kidney injury， AKI）是指各种病因引起短时间内肾功能快速减退的临床综合征，其发病机制复杂、治疗策略有限，具有高发病率、高病死率、高治疗费用及进展为慢性肾脏病的特点［1］。研究［2］显示，超50%的ICU 患者发生过AKI，AKI 可使危重症患者死亡率增加3 ～ 7 倍，每年导致约200 万人死亡，约25%的AKI 患者需接受肾脏替代治疗。然而现有医学领域对AKI 的机制认知尚浅，深入探索其病理生理机制、寻找临床治疗的潜在靶点，对改善AKI 患者预后、减轻社会经济负担具有重要意义。N6-甲基腺嘌呤（m6A）甲基化广泛存在于mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等编码和非编码RNA 中，通过调控表观遗传修饰参与多种生物学过程和疾病发生［3］。近年研究表明m6A 甲基化修饰在AKI 的发生发展中发挥重要调节作用，有望成为治疗AKI 的有效靶点。本文就m6A 在AKI 中的作用及未来可能的研究方向进行综述，以期为研究AKI 表观转录组的调控作用和研发新的临床治疗药物提供一定参考依据。

1 m6A 甲基化修饰

m6A 甲基化修饰指RNA 腺苷酸第六个氮原子的甲基化，是真核生物中最常见的RNA 修饰，占所有RNA甲基化的80%以上，多富集于3′编码区、长外显子区或接近终止密码子的RRACH（R=A，G； H=U， C， A）序列中［3］。自1974年首次报道哺乳动物的mRNA 存在m6A 修饰、1978 年证明m6A 促进mRNA 降解以及1997 年克隆并发现甲基转移酶样蛋白3（Methyltransferase-like Protein 3， METTL3）后，人们对m6 A 介导的转录后调控及其与疾病的关系进行了广泛探索。m6A 作为RNA 命运的主宰因素，通过m6A 甲基转移酶、去甲基化酶和阅读蛋白动态可逆地调控RNA 的剪接、出核、翻译、稳定性和高级结构，与生命的发育、代谢、免疫以及肿瘤等多种疾病的发生息息相关。

2 m6A 调控蛋白

m6A 三大调控蛋白动态互作形成“m6A 开关”靶控目标RNA 命运。甲基转移酶（Writer）识别目标RNA 并写入甲基化修饰，去甲基化酶（Eraser）可擦除甲基化，阅读蛋白（Reader）特异性结合m6A 位点、发挥转录后调控功能。 m6A 的修饰与擦除主要发生在细胞核，m6A 阅读发生在细胞核和细胞质中。

2.1 m6A 甲基转移酶m6A 修饰通过m6A 甲基转移酶复合物（Methyltransferase Complex， MTC）催化介导，MTC 由催化亚基（METTL3/14）和调控亚基（Wilm′s 肿瘤1 相关蛋白（WTAP）、Vir 样m6A 相关甲基转移酶（VIRMA）、含锌指CCCH 型13（ZC3H13）、RNA 结合域蛋白15（RBM15）等）组成，呈“战马形”拓扑结构［4］。METTL3 结合甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine， SAM）、直接催化m6A 修饰，METTL14 识别并结合目标RNA、变构激活和增强METTL3 催化活性，METTL3-METTL14 异二聚体组成MTC 的催化亚基［5］。调控亚基可调节催化亚基活性、RNA结合能力与区域选择性。WTAP和VIRMA组成调控亚基的核心结构。WTAP 招募并引导催化亚基核定位，与METTL3 结合稳定MTC 结构［6］。VIRMA 充当支架蛋白并介导3′编码区优先甲基化。ZC3H13 增强催化亚基活性和RNA 结合能力，与VIRMA 结合后作为桥梁连接RBM15，扩展调控亚基构象［4］。RBM15 是一种具有三个RNA 识别基序的接头蛋白，招募并促进MTC 结合目标RNA［7］。此外，少数特定底物RNA 的m6A 修饰由METTL16、METTL5 和ZCCHC4介导［8］。

2.2 m6A 去甲基化酶m6A 修饰系统的动态可逆性由去甲基化酶调控。目前已知的去甲基化酶包括脂肪和肥胖相关蛋白（Fat-mass and Obesityassociated Protein， FTO）、ALKB 同源蛋白5（AlkB Homolog 5， ALKBH5）与ALKBH3，三者均为α-酮戊二酸依赖性双加氧酶alkb 样超家族成员，以2-氧戊二酸、二价铁和氧分子为底物催化目标甲基发生羟基化，形成羟甲基后脱离氮原子完成去甲基化［9］。FTO 是首个被鉴定的去甲基化酶，可去除多种RNA 和DNA 上的甲基化修饰［10］。ALKBH5在肾脏中高表达，对mRNA 具有高效的脱甲基活性，参与核内mRNA 的输出和加工［11］。新型去甲基化酶ALKBH3 仅对tRNAs 具有底物特异性［12］。

2.3 m6A 阅读蛋白阅读蛋白识别修饰后的m6A 位点、调控修饰RNA 的生物学功能。YTH 结构域家族蛋白（YTHDF1/2/3、YTHDC1/2）、胰岛素样生长因子2-mRNA 结合蛋白1-3（IGF2BP1/2/3）、异质核糖核蛋白家族（hnRNPA2B1、hnRNPC、hnRNPG）、真核起始因子3（eIF3）是最主要的阅读蛋白。YTHDF1/2/3 是第一组被发现的胞质m6A阅读蛋白，YTHDF1 促进mRNA 翻译，YTHDF2 加速mRNA 降解，YTHDF3 与YTHDF1 和YTHDF2 相互作用增强翻译和降解［13-14］。YTHDC1 位于细胞核内，促进pre-RNA 的选择性剪接和mRNA 的核输出［15］。YTHDC2 在睾丸中高度表达，是一种RNA 解旋酶，参与调节mRNA 翻译或降解［16］。IGF2BP 1/2/3 可维持mRNA 稳定性以及调控mRNA 选择性剪接［17］。hnRNPs 家族均位于细胞核内，hnRNPA2B1 调节mRNA 剪接和microRNA 成熟［18］，hnRNPC 和hnRNPG 调节m6A 修饰转录本的加工［19］。eIF3 可结合5'UTR m6A 位点以不依赖帽的方式启动蛋白质翻译［20］。

3 m6A 在AKI 中的生物学功能

现有研究表明m6A 修饰在AKI 的发生发展中发挥重要调节作用，干预m6A 修饰机制可影响AKI 的转归，靶向调控m6A 有望成为治疗AKI 的有效靶点［21］。

3.1 m6A 与脓毒症性急性肾损伤脓毒症性急性肾损伤（septic acute kidney injury， SAKI）是ICU患者急性肾损伤的首要原因，占比超过50%，与住院时间延长、进展为慢性肾脏病和高病死率均相关［22］。目前研究表明SAKI 的多个调控机制异常均与m6A 失调相关。LIU 等［23］通过对盲肠结扎穿刺和对照组小鼠肾组织进行RNA 测序及富集分析发现，m6A 调控蛋白与两组间重要枢纽差异基因（铁死亡、细胞凋亡、PI3K-Akt、NF-Kappa B 和IL-17 等炎症信号通路）存在密切互作，其中m6A 调控蛋白对铁死亡相关mmu-miR-7212-5p/Hmox1 轴的调控机制可能具有治疗SAKI 的潜在临床意义。

3.1.1 m6A 甲基转移酶与SAKIMETTL3 是导致SAKI 发生m6A 失调的关键调控蛋白。多个研究均发现METTL3 在SAKI 模型中表达上调，遗传和药理抑制METTL3 可明显减轻SAKI 肾脏损伤和炎症反应［24-26］。METTL3 以m6A 依赖方式促进IGF2BP2结合并增强TGF-β 活化激酶1 结合蛋白（TGF-β-activated Kinase 1 Binding Protein 3， TAB 3）mRNA稳定性与表达，加重SAKI 小鼠肾脏炎症反应和程序性细胞死亡［24］。METTL3 同时可促进mmu-long非编码RNA121686 表达，通过海绵吸附miR-328-5p 解除其对高温需要因子A3（High Temperature Requirement Factor A3， HtrA3）的翻译抑制，诱导SAKI 小鼠肾小管上皮细胞凋亡［25］。METTL3 还通过m6A 修饰促进YTHDF1 介导的E3 泛素连接酶小鼠双微体基因（Murine Double Minute 2， MDM2）翻译及表达，诱导抑癌基因p53 泛素化，继而激活核纤层蛋白B1（Lamin B1， LMNB1）加重SAKI 小鼠肾小管上皮细胞线粒体损伤和铁死亡［26］。目前针对METTL3 抑制剂的研发尚处于起步阶段，干预METTL3 在SAKI 的治疗中具有极大发展空间。

3.1.2 m6A 去甲基化酶与SAKIm6A 去甲基化酶在SAKI 中的机制研究相对较少。研究发现右美托咪定可逆转SAKI 细胞模型的ALKBH5 表达上调，通过促进肺癌转移相关转录本1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）mRNA 的m6A 修饰抑制MALAT1 表达，从而影响人肾脏近端小管上皮（HK-2）细胞活力、诱导细胞凋亡、抑制炎症细胞因子产生，改善肾功能［27］。最新研究发现，RNA 结合蛋白RBM33 可招募并解除ALKBH5 的类泛素化修饰、激活其去甲基化酶活性［28］，这一机制可能为靶向调控ALKBH5以治疗SAKI 提供有效策略及新靶点。

3.1.3 m6A 阅读蛋白与SAKI阅读蛋白是m6A调控系统的最终执行者，甲基转移酶在SAKI 中介导的m6A 修饰均需依赖阅读蛋白发挥生物学功能。IGF2BP1 识别m6A 修饰直接上调E2F 转录因子1（E2F Transcription Factor 1， E2F1）表达，促进NLRP3 炎性小体的亚基巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage Migration Inhibitory Factor， MIF）转录翻译，诱导SAKI 小鼠肾小管上皮细胞焦亡［29］。脓毒症患者及脓毒症小鼠的YTHDF1 表达下调，过表达YTHDF1 可以m6A 依赖方式促进含有E3 泛素蛋白连接酶1（WW Domain Containing E3 Ubiquitin Protein Ligase 1， WWP1）翻译，引起炎症小体NLRP3 泛素化、抑制半胱天冬酶-1（Caspase-1）依赖性焦亡来缓解肾损伤［30］。

3.2 m6A 与缺血再灌注肾损伤缺血再灌注（ischemia/reperfusion， I/R）肾损伤是指肾脏在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重甚至出现不可逆的损伤现象，易导致慢性肾纤维化，在肾移植术后、老年人和糖尿病患者中常见［31］。缺血再灌注肾损伤的病理生理机制至今尚未完全阐明，现有研究发现m6A 失调可能通过调控细胞凋亡、免疫调节、自噬、纤维化等多重机制加重I/R 肾损伤［32］。

3.3 m6A 甲基转移酶与I/R-AKII/R-AKI 患者肾组织和小鼠模型中的METTL3、METTL14 等甲基转移酶表达升高。METTL3 表达水平与I/R-AKI小鼠的肾脏损伤程度直接相关，抑制或沉默METTL3 可改善I/R 诱导的肾损伤和细胞凋亡，RNA 免疫共沉淀测序结果表明METTL3 上调叉头盒D1（Foxd1）mRNA 的m6A 修饰水平，继而诱导I/R 模型细胞凋亡、加重肾损伤［33］。METTL14 的表达水平与I/R-AKI 患者的血清肌酐水平呈正相关，I/R-AKI 模型实验提示METTL14 可直接靶向增强Yes 相关蛋白1（YAP1）m6A 修饰，YTHDF1 识别m6A 修饰位点后特异性结合并促进YAP mRNA 翻译与表达，诱导肾小管间质纤维化和异常分化、加速I/R 小鼠模型肾纤维化的进展［34，35］。

3.4 m6A 去甲基化酶与I/R-AKI去甲基化转移酶在I/R-AKI 中的调控作用尚存争议。熊冰瑶等人的研究结果显示I/R-AKI 细胞模型的去甲基化酶FTO 表达下调、m6A 修饰水平上升，FTO 介导的RNA m6A 修饰可能通过抑制HK-2 细胞凋亡减轻肾损伤［36］。不同的是ZHUANG 等［37］研究发现FTO可去除过氧化物酶体增殖体激活受体γ 辅助激活因子1-α（Peroxisome Proliferator Activating Receptor γ Coactivator 1-α， PGC-1α）mRNA 的m6A 修饰，增加PGC-1α mRNA 稳定性及表达，以恢复线粒体活性、诱导氧化应激和ROS 产生，而氧化应激是介导I/R 肾小管坏死和肾功能障碍的主要机制。此外，卡格列净被发现可抑制I/R 模型去甲基化酶FTO 表达，促进自噬相关受体SQSTM1 mRNA 的m6A 修饰与表达、诱导自噬体形成，预防肾小管细胞肾纤维化［38］。还有研究显示，ALKBH5 抑制剂IOX1 可促进CC 趋化因子配体28（CC Chemokine Ligand 28， CCL28）mRNA 的m6A 修饰、增强其稳定性，从而促进调节性T 细胞分化、调节Treg/炎症细胞轴，减轻I/R 肾损伤；该作者还发现ALKBH5在I/R 小鼠肾组织中的表达具有时效性，其在造模后12 h 表达下降，24 ～ 48 h 急剧上升，120 h 恢复至正常［39］。m6A 修饰在AKI 中的不同作用可能与调控蛋白的功能具有多面性以及调控蛋白表达随AKI 的发病时间而变化等因素相关，其具体机理仍需更多研究进一步挖掘。

3.5 m6A 与肾毒性药物相关急性肾损伤肾毒性药物暴露是急性肾损伤的重要原因之一，约25%的AKI 病例由肾毒性药物暴露所导致［40］。顺铂所致急性肾损伤是肿瘤患者化疗的常见并发症［41］。研究发现顺铂治疗可改变肾脏中的m6A修饰谱。与对照组相比，顺铂诱导的AKI 小鼠METTL3 和ALKBH5 表达升高、FTO 表达降低、m6A修饰总水平上调，两组间存在多个显著甲基化差异基因，主要富集于代谢和细胞死亡通路［42］。过表达FTO 可降低p53 mRNA 的m6A 修饰水平、下调p53 表达，逆转顺铂诱导的HK2 细胞凋亡和肾功能损伤［43］。此外，m6A 转录图谱分析提示致癌物质镉（Cadmium， Cd）所致急性肾损伤模型m6A 水平和m6A 调控蛋白表达均上调，m6A 可能通过调控炎症和代谢相关基因影响Cd诱导的肾损伤［44］。有研究观察到在黏菌素所致AKI 模型中，METTL3 表达下降导致m6A 失调，过表达METTL3 可以m6A依赖方式促进miR-873-5p pre-mRNA 的剪接和成熟，miR-873-5p 可上调Nrf2/HO-1 表达以对抗黏菌素诱导的氧化应激和细胞凋亡［45］。

4 展望与未来

作为RNA 中最普遍的修饰，m6A 将表观转录组学与AKI 的发生发展相联系，影响肾脏的炎症反应、程序性细胞死亡、代谢、氧化应激、修复等过程，因此m6A 修饰调控蛋白有望成为AKI 诊治和药物开发的潜在分子靶标。临床研究发现尿m6A调控蛋白在糖尿病肾病患者中显著降低并随肾功能恶化而下降［46］，m6A 调控蛋白能否作为AKI 的早期诊断及病情严重程度评估标志物的临床应用也极具潜力。目前AKI 中m6A 修饰的研究仍处于早期阶段并且具有争议，m6A 失调似乎起“双刃剑”作用，可能与m6A 修饰在表达上具有时效性、功能上具有多面性和可调节性相关。同时m6A 修饰的上游调控机制及m6A 修饰介导的RNA 与DNA 之间的串扰作用在AKI 中的影响尚不明确，目前仍需进一步研究为急性肾损伤的发生发展提供深入见解。

【Author contributions】TANG Lili consulted relevant references and wrote the article. WANG Xinyu and ZHANG Jie revised the article； ZHAO Yue and LI Xiaoyue reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.