基于网络药理学与分子对接探讨参芪白石汤治疗胃癌的机制

杨从影,唐莉华,孙龙华,罗 江,黄学娣

(1.江西省中西医结合医院 药物临床试验机构办公室,江西 南昌 330002;2.南昌大学第一附属医院 呼吸内科,江西 南昌 330006)

胃癌(gastric cancer,GC)起源于黏膜上皮细胞,是常见的消化道恶性肿瘤之一,是全球第四大常见癌症,我国发病率位居世界第二[1-2]。中医认为,胃癌是素体脾胃亏虚,复加外感六淫,饮食失调、情志紊乱等多种因素,导致气血痰湿毒等多种病理产物夹杂的结果,归纳为痰气瘀滞、胃热伤阴、寒凝气滞[3];治疗多以化痰解毒、健脾益气、温中散寒为主,且不良反应少,契合胃癌复杂的病情特点[4-6]。

参芪白石汤(SBD)由党参、黄芪、白术、白英、白花蛇舌草等中草药组成,有健脾利湿、清热解毒之功效,用于晚期胃癌、正虚邪实者,可随症加减[7]。本研究通过数据挖掘、GEO数据库和分子对接的网络药理学方法,探讨SBD治疗胃癌GC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 SBD有效成分及靶点挖掘 通过查阅文献[8]可知,SBD由白花蛇舌草、白术、黄芪、党参、七叶一枝花、仙鹤草、石见穿、薏仁、白英9味中药组成,利用中药系统药理学分析平台 TCMSP( http: // lsp. nwu. edu. cn / tcmsp. Php)设置口服生物利用度 ( OB) ≥ 30% 、类药性 (DL) ≥0.18筛选,并结合《中药大辞典》进行补充,最后利用有机小分子生物活性数据 Pubchem ( https: // pubchem. ncbi. nlm. nih. gov / ) ,查询筛选出的化合物结构式,并复制化合物的 SMILES 表达式,通过SIB分子构效相似性分析平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测靶点蛋白,然后使用Uniprot(http://www.uniprot.org)数据库将所得靶点蛋白进行规范化处理。

1.2 GC差异表达基因的筛选 从 GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索组织来源为人,同时含有胃癌组织和正常胃组织样本的基因表达数据集,筛选出 GSE118916探针芯片数据集,包含15个胃癌组织和 15个正常胃组织样本基因表达谱,并利用 R语言的Limma 软件包对芯片进行基因差异分析,用python软件绘制火山图,根据相关参数P.adjust<0.05和差异倍数logFC>1或<-1作为筛选条件。

1.3 交集靶点获取及核心基因的筛选 为进一步明确药物作用靶点与GC差异表达基因之间的关系,本研究将上述药物与疾病靶点信息输入在线Venn分析工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),绘制韦恩图,获得药物与疾病的交集靶点,然后将交集靶点输入蛋白互作和预测数据库STRING(https://string-db.org/),生物种类选择“Homo sapiens”,阈值设置为“medium confidence”(>0.4),其他参数选择默认值,得到交集靶蛋白PPI网络图。并获取其tsv格式,将其导入Cytoscape软件中“Network Analyzer”插件分析网络中各靶点的度中心性(DC)、中介中心性(BC)和紧密中心性(CC)3种拓扑属性。

1.4 PPI蛋白互作网络构建 利用蛋白互作和预测STRING 在线数据库( https: // string-db.org / ) 构建核心靶点的蛋白-蛋白互作网络即PPI网络,利用Cytoscape v 3.9.1构建可视化网络图,并利用“Network Analyzer”插件根据DC、BC、CC值绘制核心靶蛋白PPI网络图。

1.5 GO和KEGG功能富集分析 将核心靶点导入在线分析平台Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1),以“Homo sapiens”背景,设置阈值为,P Value Cutoff<0.01、Min Overlap(最小计数为3)、Min Enrichment(富集因子)>1.5, 对核心基因进行GO和KEGG功能富集分析。

1.6 核心基因的数据库验证 通过THPA(The Human Proterin Atlas)数据库(https://www.proteinatlas.org/)获得核心基因的蛋白表达情况,分析核心基因的蛋白免疫组化结果。

1.7 核心基因与主要化合物分子对接 通过Pubchem数据库下载SBD中主要成分的2D结构,利用Chem3D21.0将小分子化合物的2D结构转化为3D结构,在PDB数据库 (http://www.rcsb.org/)中获得蛋白三维结构并保存为PDB格式,用Pymol对蛋白去水及官能团,并用AutoDock加氢,保存为pdbqt格式作为分子对接受体,采用Vina1.2.0软件进行分子对接,调整对接盒子大小到刚好包含蛋白的结合位点,并选取对接最佳构象作为分子对接结果,对结合能 (affinity) 评分并进行排序,结合能数值越低,表明结合越好,最后使用Pymol软件对所得对接结果进行可视化展示。

2 结果

2.1 SBD活性成分筛选及靶点 通过查阅文献得到SBD由9味中药组成,在TCMSP数据库中根据筛选条件OB≥30%和 DL≥0.18,共获得63种有效成分,见表1,通过SIB分子构效相似性分析平台,去重后使用Uniprot 数据库将所得靶点蛋白进行规范化处理,结果共获得930个有效靶点。

表1 SBD有效成分信息

2.2 GC差异表达基因获取 使用 R语言Limma软件包对GSE118916探针芯片数据集进行基因差异分析,去重后获得1 933个GC差异表达基因,其中上调759 个,下调有1 174个,结果用生信绘制火山图,如图1所示。

图1 GC差异表达基因火山图

2.3 交集靶点获取及核心基因的筛选 将SBD对应靶点与GC差异表达基因导入Venn分析工具,共获得交集靶点142个,将其导入STRING数据平台中构建PPI网络图,见图2,去除未参与相互作用靶点,共有133个节点,534条边,平均度值8.03,采用DC、BC、CC 3个参数来选择节点,通过第一轮筛选阈值DC≥11、BC≥0.368、CC≥0.024,得到25条边和110个节点;第二轮筛选阈值为DC≥17、BC≥0.015、CC≥0.447,共10条边,41个节点。核心靶点及拓扑参数信息见表2。

注:A.交集靶点PPI蛋白互作网络图,线的粗细表示置信度大小;B.采用DC、BC、CC 3个参数来选择节点,DC值越高的节点颜色越鲜艳、越大。

表2 SBD治疗GC的核心靶点及其拓扑参

2.4 GO和KEGG功能富集分析 在Metascape在线数据库平台对10个核心靶点进行GO生物过程富集分析,经过筛选共涉及14个生物过程条目,包括平滑肌细胞增殖的调节、平滑肌细胞增殖的正向调节、对肽的反应、凋亡过程的正向调节、血管相关平滑肌细胞增殖的调节等。见表3。

表3 14个GO生物过程的聚类条目富集分析结果

为了进一步分析GO条目间的关系,选取子集丰富的条目,其中相似性为> 0.3的条目由边连接,选择P值最好的条目,限定每个聚类中的条目不超过15个,总数不超过250个,使用Cytoscape对网络进行可视化,见图3,其中每个节点表示一个GO条目。

注:A.按富集分析结果集群分类着色,具有相同集群的节点通常彼此靠近;B.根据P值大小,颜色越浅P值越大,P值越显著富集的基因越多。

KEGG通路富集分析,设置阈值为:P Value Cutoff<0.01,Min Overlap(最小计数为3)、Min Enrichment(富集因子)>1.5。经过筛选,核心基因显著富集在15条通路上(FDR<0.05),涉及癌症通路、肿瘤坏死因子信号通路、脂质和动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等,见表4、图4。

表4 排名前4个KEGG聚类条目富集分析结果

2.5 核心靶点的数据库验证 通过THPA数据库获得核心基因的蛋白免疫组化结果,如封三图2所示,ICAM1、PTGS2、PPARG在GC组织中呈强阳性表达,PTGS2在正常组织中不表达,PPARG在正常组织中呈高表达,ICAM1在正常组织中呈中等表达;MMP9在GC组织中呈中等表达,在正常组织中不表达。

2.6 核心靶点与主要有效成分分子对接 根据度值排名选取度值较高的槲皮素Quercetin(degree=29)、3-Epioleanolic acid 3-表齐墩果酸(degree=51)、diosgenin,1薯蓣皂苷(degree=23)、Foliosidine单叶芸香定(degree=20)、Mandenol扁桃醇(degree=17)与11个核心靶点进行分子对接,对接结果均小于-5.0 kcal/mol,说明SBD的主要生物活性成分与靶点具有较强的结合活性结合能,其中3-表齐墩果酸和槲皮素与核心靶点结合性最优(图5),IL6、PTGS2与3-表齐墩果酸结合能分别为-8.1 kcal/mol、-7.9 kcal/mol;MMP-2、MMP-9与槲皮素结合能分别为-8.8 kcal/mol、-8.0 kcal/mol。

注:A. IL-6&3-Epioleanolic acid;B. MMP-2&Quercetin;C.PTGS2&3-Epioleanolic acid;D. MMP-9&Quercetin。

3 讨论

中医药具有多成分、多靶点的药效作用,能整体调节机体的异常活动。基于“扶正祛邪、顾护胃气”的总体治疗原则,中医药在改善胃癌患者生活质量方面有独特的作用,如有效改善患者手术前后及放化疗后的生活质量,能协调机体内阴阳平衡,纠正肿瘤紊乱的气机,达到驱逐邪气癌毒、抑制甚至杀死癌细胞的目的[9-10]。近年来,网络药理学成为胃癌治疗的研究热点,能以科学的分析全面地阐述中药复方潜在的作用机制[11]。本研究基于网络药理学的方法,分析参芪白石汤有效成分治疗胃癌的基因和通路机制,并通过分子对接技术进行验证,以期为SBD治疗GC提供理论依据。

槲皮素(quercetin,QE)是一种广泛分布在水果、蔬菜及常见中草药之中的天然黄酮类化合物,具有抗炎、抗癌、抗氧化等多种作用[12-13],其作为一种天然的抗肿瘤药物,已得到广泛的认可[14]。槲皮素可抑制胃癌细胞增殖和侵袭,诱导其发生自噬、促进其凋亡,其机制可能与下调MMP-2基因表达有关[15-16]。动物试验表明斛皮素的抗肿瘤机制通过对GC细胞G1期的阻断作用,从而导致细胞分裂的延期[17]。这与本研究结果一致。3-表齐墩果酸是齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)的衍生物,OA是常见的天然产物,属于五环三萜类化合物,以游离体及糖苷的形式存在于多种植物中,具有广泛的生物活性,如保肝、降糖、降脂、抗肿瘤、抗高血压、抗炎和抗 HIV 感染等[18]。本研究结果也显示3-表齐墩果酸为抗GC的主要有效成分。基质金属蛋白(matrix metalloproteinase MMP)家族成员中的 MMP-9和 MMP-2能有效地分解基底膜的主要成分IV型胶原蛋白,是一组锌离子依赖性肽链内切酶[19-20],两者的过度表达与人类某些恶性肿瘤的转移密切相关[21-22],主要由肿瘤细胞和肿瘤周边间质细胞产生,通过对细胞外基质的重塑促进肿瘤新生血管的生成,从而实现肿瘤的侵袭和转移。研究发现,胃癌组织中MMP-2表达与淋巴结转移和浸润密切相关[23-24],这与本研究结果一致。前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)是前列腺生物合成的限速酶,对前列腺素的合成起着关键性的调控,已证实在许多病理生理过程中发挥着重要作用,是肿瘤、癌症形成的促进剂[25],与本研究结果相符。IL6是由活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子,在炎症和 B细胞成熟中起重要作用,其功能与多种疾病的发生发展有关,如白血病、糖尿病等[26],IL6 基因的基因多态性与胃癌风险增加具有相关性[27],与本研究结果相符。

KEGG通路富集分析结果显示,SBD治疗GC的潜在作用机制除了直接作用于癌症通路、肿瘤坏死因子信号通路、癌症中的转录失调以及金属铂耐药,还包括脂质和动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、白细胞跨内皮细胞迁移、流体剪切应力和动脉粥样硬化、IL-17 信号通路、NF-kB信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞粘附分子等。流体剪切应力可以调节血管内皮细胞中相关基因的表达,影响着内皮细胞的形态、分化、迁移和增殖[28]。

综上所述,SBD具有多成分、多靶点、多通路抗GC的特点,通过主要活性成分槲皮素、3-表齐墩果酸协同作用于GC相关通路从而发挥抗癌作用,为进一步的实验研究提供了新的理论依据。但是中药复方成分复杂,本文数据是通过一些数据库获得的,数据库的信息还需要进一步完善且缺乏实验支持,其机理有待进一步实验验证。