云南白菜根肿病拮抗菌的筛选及鉴定

张怡宁,刘秋艳,朱美竹,曾 民,苏 源,梁家灿,刘 庆,姚永兴,周晓罡

(1.昆明学院农学与生命科学学院,昆明 650214;2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,昆明 650223;3.云南省农业生物技术重点实验室,昆明 650223;4.农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室,昆明 650223;5.云南昊盟农业科技有限公司,云南 楚雄 651604)

【研究意义】十字花科蔬菜在中国具有重要的经济价值,根肿病是十字花科作物的主要病害[1]。据统计,在云南超过10个州市(49 个县区)均有根肿病发生,发病面积达1.64×104hm2。因云南蔬菜周年可生产上市的特点,导致其全年发病,危害极其严重,是影响云南大白菜及其他十字花科蔬菜产量的主要因素[2-3]。目前主要采用化学农药对根肿病进行防治,但化学农药的广泛使用会造成环境污染,同时也存在成本较高的问题。本研究拟从白菜植株内及其根际土壤中筛选对云南白菜根肿病有较好防治效果的生防菌株,并对其进行深入研究,包括生防菌株的筛选鉴定、发酵培养组分的优化等,以期筛选到具生防潜能的菌株,对白菜根肿病具备良好的生物防治效果,同时提供可供参考的理论指导[4]。【前人研究进展】作为一种严重影响十字花科蔬菜产量和品质的真菌病害[5-6],芸薹根肿菌无法在体外进行培养[7-8]。因此目前对白菜根肿病的防治,主要是通过对病原菌休眠孢子萌发抑制率的检测来进行。王靖等[9]通过对病原菌休眠孢子萌发抑制率的检测获得2株田间生防效果较好的放线菌,A316和A10的防治效果分别为65.84%、59.59%。熊国如等[10]通过对病原指示菌的筛选得到1株枯草芽孢杆菌BacillussubtilisXF-1,XF-1不仅对大白菜根肿病的发生具有很好的抑制作用,而且还能提高大白菜的产量;张思雨[4]通过对病原指示菌的筛选得到4株生防菌,其在田间的抑制效果良好,生防菌及其抑制率为ZF480(64.08%)、ZF481(60.61%)、ZF72(63.82%)和ZF129(64.94%)。蒋欢等[11]通过大田试验发现,放线菌B18对榨菜根肿病的田间防效为42.01%,增产率为37.24%。杨力凡[12]研究发现,将深绿霉菌的发酵物添加到化肥中,可有效减少大田中根肿病的发病率;盘文政等[13]将有机肥和生防菌株混合使用防治油菜根肿病,结果表明其田间防效可达83.12%。【本研究切入点】生物防控因其成本低、效果好、对环境无污染等优点成为近年来防治植物病害的首要选择。目前云南省白菜的主要病害为根肿病,危害程度较大,年均造成十字花科作物减产25%～60%[14-15]。笔者拟通过原位筛选技术从云南本地筛选获得对十字花科根肿病具有高效拮抗作用的生防菌株加以应用,为解决云南省日益严重的根肿病害提供新的微生物资源。【拟解决的关键问题】通过筛选获得对云南白菜根肿病具有高效生物防治功能且能够适应云南高海拔、强紫外线生态环境的菌株。并对该菌株进行生理生化鉴定,优化发酵条件,为其应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

在云南省曲靖市麒麟区三宝乡白菜种植大棚内进行采样,整个地块均有发病且发病症状较均匀,白菜根肿病的全茬发病率为60%～70%。

1.2 供试材料

供试白菜(Brassicarapavar.glabraRegel)品种为易感品种曲彩一号。牛肉膏蛋白胨液体培养基和固体培养基参考王靖[16]的方法略作改动,Hoagland营养液的配制参考罗红春[17]的方法。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集 采用五点取样法采集白菜根际周围0～20 cm土层的带根土样,每个点取0.5 kg,将5个样品混匀后平均分成2份保存备用。采用随机取样法采集健康或者发病较轻的白菜10株,保存于4 ℃冰箱备用。

1.3.2 白菜根系分泌物的收集 参考王靖[16]的实验方法略作改动,将白菜种子(曲彩一号)在25 ℃恒温培养箱中催芽2～3 d,待出芽后转入装有水培营养液的100 mL小烧杯中,每个烧杯中插苗5株,置于恒温培养箱,25 ℃中光暗交替培养7 d,用0.22 μm的细菌过滤器过滤后保存于4 ℃冰箱中备用。

1.3.3 休眠孢子悬浮液的制备 试验步骤(图1)参考杨佩文等[18]的方法并有所改动。

图1 根肿病菌休眠孢子悬浮液制备工艺Fig.1 Preparation technology of suspension liquid of dormant spores of P.brassicae

1.3.4 芽孢杆菌的分离纯化 土壤中芽孢杆菌的分离纯化:在锥形瓶中加入土样5 g,无菌水50 mL,振荡器上充分震荡混匀。70 ℃水浴加热10 min,经过梯度稀释后得到10-3、10-4、和10-5土壤稀释液。分别取各梯度的稀释液100 μL 涂布于NA固体培养基上,3组重复, 37 ℃倒置培养3～4 d。挑取单菌落于NA固体培养基上平板划线进行分离纯化。纯化出的菌体保存于4 ℃冰箱中备用。

白菜内芽孢杆菌的分离纯化:称取采集白菜的健康组织10 g,用水冲洗干净。使用75%酒精消毒2～3 min,次氯酸钠消毒1～2 min,无菌水冲洗后,放入研钵充分研磨,研磨液70 ℃水浴加热10 min,稀释成500和1000倍的稀释液。纯化方法同“土壤中芽孢杆菌的分离纯化”。纯化出的菌体保存于4 ℃冰箱中备用。

1.3.5 拮抗菌株的筛选 将上述保存的菌株活化,制成1×106个孢子/mL的待测菌株培养液。将根系分泌物121 ℃灭菌20 min,取5 mL加入锥形瓶中,同时将根肿病菌休眠孢子悬浮液和待测菌株培养液各0.5 mL接种到锥形瓶中。对照组将待测菌株培养液替换为无菌水,其他条件不变,pH 6.3,放入恒温培养箱,温度设置为24 ℃,黑暗培养,每组实验3个重复。5 d后镜检。

白菜根肿病菌休眠孢子的萌发通过地衣红染色法(1%)[19]判定。通过显微镜观察孢子的萌发情况,未萌发的孢子呈红色,萌发的休眠孢子呈透明色。

休眠孢子萌发率(%)=孢子萌发数/调查孢子总数×100

(1)

孢子抑制率(%)=[(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率]×100

(2)

1.3.6 拮抗菌株的鉴定 培养性状观察:参照东秀珠等[20]的方法进行菌株鉴定。将筛选得到的休眠孢子抑制率最高的拮抗菌接种于NA固体培养基上,采用平板划线法分离单菌落,倒置培养2～3 d,温度37 ℃。培养结束后观察菌落的大小、颜色、表面特征、边缘形状等初步判定菌株类型。

形态特征观察:对上述拮抗细菌分别进行革兰氏染色和芽孢染色,100×油镜下观察拮抗菌株的个体形态及染色情况。

生理生化指标检测:用HBI微生物生化鉴定条(购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)对上述拮抗细菌进行生理生化检测。

分子序列分析:采用细菌基因组DNA提取试剂盒(购于北京全式金生物技术有限公司)对上述拮抗菌株进行DNA提取。PCR扩增引物采用细菌16S rDNA通用引物。PCR反应总体系见表1,反应程序见表2。PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳确定大小,并送至生物公司进行测序分析。利用软件MEGA6.0将测序结果进行对比分析,构建系统发育树,确定其种属。

表1 PCR反应总体系

表2 PCR反应程序

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的筛选

从土壤样品和白菜样品中共分离到46株细菌,对白菜根肿病菌休眠孢子抑制率在60%以上的有2株(图2),抑制率在50%～60%的有15株,抑制率在50%以下的有29株。其中抑制效果最好的为TB-7菌株,抑制率为76.88%。

萌发的根肿病菌休眠孢子呈透明,未萌发的根肿病菌休眠孢子呈红色。The uncolored ones are germinated dormant spores, and the colored (red) ones are ungerminated dormant spores.

从土壤样品中共分离出30株细菌,编号为TB-1～TB-30,其中对白菜根肿病菌休眠孢子萌发抑制率达到50%以上的有13株(表3)。抑制效果最好的是TB-7菌株,抑制率为76.88%。

表3 土壤中部分菌株对白菜根肿病菌休眠孢子的抑制率

从白菜内共分离出16株细菌,编号为EB-1～EB-16,其中对白菜根肿病休眠孢子萌发抑制率达到50%以上的有8株(表4)。抑制效果最好的是EB-15菌株,其抑制率为67.38%。

表4 白菜内部分菌株对根肿病菌休眠孢子的抑制率

2.2 拮抗菌株的鉴定

TB-7菌株在NA固体培养基上菌落较小(图3),颜色呈淡黄色,表面光滑且扁平,菌体湿润,不透明,边缘呈规则状。

图3 TB-7菌株的菌落形态Fig.3 Colony morphology of TB-7

革兰氏染色结果如图4所示,TB-7菌株的菌体均呈紫色、杆状,为革兰氏阳性菌;芽孢染色结果如图5所示,TB-7菌株的菌体和芽孢分别被染成红色和绿色,为芽孢杆菌。

图4 TB-7菌株革兰氏染色Fig.4 Gram stain of TB-7

图5 TB-7菌株芽孢染色Fig.5 Spore staining of TB-7

生理生化指标检测结果从表5可见,TB-7菌株是好氧菌,V-P、淀粉水解、pH 5.7生长3项检测指标均呈阳性,柠檬酸盐、丙酸盐、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、明胶液化、7%NaCl生长、硝酸盐还原8项检测指标均呈阴性。因芽孢杆菌多为需氧或兼性厌氧,能耐酸、耐盐、耐高温且具有较高的淀粉酶活性,可初步判定TB-7菌株为芽孢杆菌。

表5 TB-7菌株生理生化指标检测

对TB-7菌株的DNA提取物进行PCR扩增后,将扩增产物进行电泳检测(图6),条带亮度位置约在1500 bp处。将测序结果在NBCI数据库中进行Blast同源性分析,用软件MEGA6.0进行序列对比(图7),TB-7菌株与坚强芽孢杆菌(Cytobacillusfirmus)同源性达到100%,TB-7菌株为芽孢杆菌属的坚强芽孢杆菌。TB-7菌株的16S rDNA测序序列如图8所示。

图6 TB-7菌株16S rDNA PCR产物Fig.6 16S rDNA PCR products of TB-7

图7 TB-7菌株系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree of strain TB-7

图8 TB-7菌株16S rDNA序列Fig.8 16S rDNA sequence of strain TB-7

3 讨 论

目前,中国研发的生物农药种类颇多,在册登记产品数量超过1200个,其中有效成分50多种。然而这些产品中用于十字花科蔬菜根肿病防治的生物农药只有1种,为枯草芽孢杆菌[21]。芽孢杆菌相对于其他菌类而言,具有强抗逆性、光谱抗菌性等特点。所以在各种农作物的病害防治方面应得到广泛应用。近年来,用于农作物病虫害防治的芽孢杆菌种类较多,最常见的有地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌巨大芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌等[22-24]。

形态学鉴定、生理生化检测和DNA分子序列分析显示本研究筛选到的TB-7菌株为芽孢杆菌属的坚强芽孢杆菌。

十字花科蔬菜根肿病菌难以在体外进行培养,只能专性寄生于活体内[25-26],依靠在体外人工纯培养的根肿病菌来筛选其生物防治菌株十分困难。目前主要通过病原指示菌筛选和根肿病菌休眠孢子萌发抑制率的测定获得根肿病的生防菌株。Lee等[26]从韩国大白菜的根部分离出3株对十字花科根肿病有良好防治效果的内生放线菌。孙良菲等[27]结合休眠孢子萌发抑制率筛选和病原指示菌筛选,获得1株放线菌YN-6和1株真菌XP-F2,其对感病品种“四季奶油小白菜”根肿病有较好的生物防治效果。

本研究通过测定根肿病菌休眠孢子萌发抑制率来筛选对白菜根肿病具有抑菌作用的拮抗菌,经过筛选获得对白菜根肿病菌休眠孢子萌发抑制率最高的菌株TB-7,其抑制率为76.88%。TB-7菌株经鉴定为芽孢杆菌属的坚强芽孢杆菌,目前鲜见其在根肿病防治应用方面的报道。本实验通过检测根肿病菌休眠孢子的萌发抑制率,筛选获得的TB-7菌株对抑制根肿病具有较强的针对性,后期笔者将通过盆栽试验和田间试验对TB-7菌株生防效果进行深入研究,以期为解决云南日益严重的十字花科作物根肿病提供新的菌种资源。

4 结 论

从白菜及其根际土壤中共分离出46株细菌,其中根际土壤中分离出30株细菌,白菜内分离出16株内生细菌。对白菜根肿病休眠孢子萌发抑制效果最好的是TB-7菌株,休眠孢子抑制率为76.88%。TB-7菌株是革兰氏阳性菌,在NA培养基上菌落较小,颜色呈淡黄色,表面光滑且扁平,菌体湿润,不透明,边缘呈规则状。TB-7菌株的分子测序结果为TB-7菌株的16S rDNA电泳条带亮度位置约在1500 bp处;TB-7菌株与坚强芽孢杆菌(Cytobacillusfirmus)同源性达到100%,判定TB-7菌株为芽孢杆菌属的坚强芽孢杆菌。