深色有隔内生真菌对NaCl胁迫下白皮松幼苗生长、光合荧光及离子吸收的影响

2024-03-13赵梓彭张睿捷王晓娜

西南农业学报 2024年1期

徐朗,赵梓彭,谢冰,郭畅,张睿捷,王晓娜

(河北农业大学园林与旅游学院,河北保定 071000)

【研究意义】白皮松(Pinusbungeana)皮色独特、四季常青,极具观赏价值。但白皮松的耐盐性较弱,观赏与经济价值受到极大影响[1]。有研究表明,植物根际或根内的微生物能同植物形成互惠共生的协作方式,提高植物对环境的适应性[2-3]。深色有隔内生真菌(DSE)是一类利于植物生长发育的内生真菌,分布广泛且非专性寄生。因此,研究盐环境下DSE真菌对白皮松生长发育的影响,对提高白皮松观赏与经济价值具有重要意义。【前人研究进展】盐胁迫下,细胞内过高的盐分含量对植物有毒害作用,Na+的过度积累会引发许多次生效应,如生长受限,抑制叶片的光合作用和蒸腾作用等[4-6]。K+和Na+结合的转运系统是植物耐盐性的关键决定因素[7]。Na+会与K+竞争结合根系细胞位点和转运蛋白,继而在植物体内易位、沉积和分区。一旦细胞储存盐的能力耗尽,盐分就会在细胞间隙积聚,从而导致细胞脱水和死亡[8]。当前DSE真菌已被发现对提高植物耐盐能力具有重要作用。Pan等[9]从分离自碱蓬(Suaedasalsa)的Curvulariasp.菌株可以通过提高毛白杨(Populustomentosa)的SOD和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性,增加叶绿素和脯氨酸含量,减轻盐胁迫对毛白杨的不利影响。魏苗[10]将分离自黑枸杞(Lyciumruthenicum)根部的DSE真菌回接于黑枸杞植株,可以改善盐环境中黑枸杞的生理指标,提高地下与地上生物量,提高根体积根面积等,降低钠离子对黑枸杞的毒害。邓勋等[11-12]发现,将Phialocephalahelvetica回接于樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)植株有助于提高叶绿素含量,增强光合作用效率,进而促进寄主生物量的积累。除此之外,Hou等[13]研究发现NaCl 胁迫处理下,接种DSE菌株会影响油蒿(Artemisiaordosica)根际土壤微生境,增加根际微生物丰度,有助于提高植物在盐碱环境下的生态适应性。【本研究切入点】当前白皮松的研究主要集中在天然林地的分布规律[14-15]、群落特征及其多样性[16]、白皮松种实性状[17-18]、白皮松生物量、碳氮分配[19]等,而对提高白皮松的耐盐性[1,20]的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究以白皮松为材料,通过菌株回接盆栽试验,研究DSE菌株对白皮松的生长、光合荧光和K+、Na+离子含量的影响,探究DSE对提高白皮松耐盐性的影响,同时为生物技术修复盐渍化土壤提供理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 土壤基质

由保定农田土与洗净的河沙组成,分别过2 mm 筛后,以沙土比 3∶2(v/v)混匀,再经过高温高压灭菌处理(121 ℃,0.1 Mpa,2 h)备用。

1.2 供试植物与菌种

供试白皮松无菌苗:于2021年5月,在智能温室中。挑选果实饱满、颗粒均匀的白皮松种子,灭菌处理后放入70 ℃无菌温水中浸泡进行催芽处理,24 h换水1次。待种壳出现裂口,挑选并转移种子于75%酒精灭菌的装有培养基质的穴盘中,每穴2粒,培育期间仅以无菌水灌溉。

供试菌种为分离自白皮松根系的4株DSE真菌:Paraphomaradicina(Pr),Phialophoramustea(Pm),Alternariatenuissima(At),Acrocalymmavagum(Av)。

1.3 试验设计

试验包括NaCl胁迫和接种处理,其中NaCl胁迫设置4个浓度水平:0%、0.1%、0.2%、0.3% ;分别接种P.radicina(Pr),P.mustea(Pm),A.tenuissima(At),A.vagum(Av)和未接种对照(CK)组,每个处理3个重复。2022年6月取1.5 kg混合基质加入灭菌种植袋(75 %酒精灭菌)中,将2个直径9 mm接种了DSE的PDA菌饼(约20 g)放置于基质上层,CK组则加入2个未接菌的PDA培养基,其上种植苗龄1年(高约6 cm)且长势一致的白皮松幼苗,每盆4株,然后覆填1.5 kg混合基质进行培养,无菌水灌溉。待幼苗生长1个月后,随机挑选白皮松幼苗观测侵染情况,确定菌株侵染白皮松幼苗后,进行NaCl胁迫处理。为避免盐激处理,每隔1 d增加50 mL 0.34 mol/L NaCl,直至达到预定胁迫浓度[21]。胁迫第30天测定光合荧光参数,次日收获以测定其他相关指标。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 侵染率测定根据陈思杰[22]观察枸杞根系深色有隔内生真菌侵染的方法,以台盼蓝为染色液进行染色,显微镜观察并统计DSE的定殖率。

1.4.2 生物量测定每个处理选取3株幼苗,分为地上和地下两部分,清水洗去土壤后控干水分,105 ℃杀青后于80 ℃烘干直至恒重,测量各部分平均生物量。

1.4.3 光合荧光参数测定参考李得孝[23]的方法测定总叶绿素含量;采用LI-6400便携式光合测定仪(美国 Li-COR公司)于上午9:00—12:00,选取长势一致的叶片测定光合参数。测定叶绿素荧光参数使用FluorPen手持式叶绿素荧光仪(PSI,捷克),测量前用叶夹进行30 min暗适应。

1.4.4 矿质营养测定采用湿消化法测定K+和Na+的含量[24]。

1.5 数据处理

利用SPSS 26软件对数据进行统计分析,使用 Duncan法检验不同处理组均值的差异(P<0.05),利用 Excel 2020进行绘图。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对白皮松DSE侵染率的影响

NaCl胁迫处理30 d后对白皮松幼苗根系组织进行显微观测,分析各菌株侵染率。如图1所示,随着NaCl胁迫的增加,Pr菌株的侵染率呈上升趋势;Pm和Av菌株的侵染率呈先上升后下降趋势,在0.2% NaCl浓度达到最高,分别为75%、71.7%;At菌株的侵染率在0.1% NaCl浓度下最高,为72.7%。结果表明,适度的NaCl胁迫可促进侵染率的提高。

不同小写字母表示菌种处理间差异显著(P<0.05)。0.0%, 0.1%, 0.2%和0.3 %表示不同的NaCl浓度。下同。Different small letters above the error bars indicate significant difference among the inoculation treatments(P <0.05). 0.0%, 0.1%, 0.2% and 0.3% indicate different NaCl concentrations. The same as below.

2.2 接种DSE对NaCl胁迫下白皮松生物量的影响

如图2所示,随着NaCl胁迫的增加,白皮松生物量总体随盐浓度的增加而呈下降趋势。对比CK处理,在0% NaCl浓度下,接种Pr、Pm、Av菌株的白皮松地上、地下及总生物量显著高于CK。在0.1% NaCl浓度下,接菌白皮松地上生物量均显著提高;而接种Av菌株的白皮松地下和总生物量显著高于CK组白皮松。在0.2% NaCl浓度下,接种Pr、Av菌株对幼苗地上生物量提高显著,分别提高17.6%、18.0%;接种Pr菌株的白皮松地下和总生物量显著提高。而在0.3% NaCl浓度下,接种Pr、Pm、At、Av菌株的白皮松地上生物量分别提高76.0%、38.8%、36.5%、51.3%,地下生物量分别提高28.5%、45.9%、29.7%、44.5%,总生物量分别提高66.7%、41.3%、34.1%、48.9%。

图2 NaCl胁迫下接种DSE对白皮松生物量的影响Fig.2 Effects of DSEs inoculation on biomass of P. bungeana under NaCl stress

2.3 接种DSE对NaCl胁迫下白皮松总叶绿素含量的影响

如图3所示,NaCl胁迫降低了白皮松总叶绿素含量。接菌处理可缓解胁迫下白皮松总叶绿素含量的降低。在0% NaCl浓度下,接菌白皮松叶绿素含量显著高于CK组;在0.1% NaCl浓度下,接种Pr菌株叶绿素含量是CK组的1.27倍,其余接菌处理白皮松叶绿素含量无显著变化;在0.2%和0.3% NaCl浓度下,接种菌白皮松叶绿素含量均显著高于CK组。

图3 NaCl胁迫下接种DSE对白皮松总叶绿素含量的影响Fig.3 Effects of DSEs inoculation on total chlorophyll content of P. bungeana under NaCl stress

2.4 接种DSE对NaCl胁迫下白皮松光合参数的影响

如图4所示,NaCl胁迫使白皮松各项参数明显降低。对比CK组,在0% NaCl浓度下,接菌白皮松净光合速率提高;接种Pr、Pm、At菌株提高白皮松的气孔导度,分别是CK组的1.9、1.64、2.8倍;接种Pr菌株白皮松的蒸腾速率低于CK组,其余处理无显著变化。在0.1% NaCl浓度下,接菌白皮松净光合速率、气孔导度均显著高于CK组;接种Pr菌株的蒸腾速率出现降低,而Pm、At菌株蒸腾速率高于CK组。在0.2% NaCl浓度下,接种Pr、Av菌株的白皮松净光合速率和气孔导度均高于CK组,蒸腾速率各接菌处理无显著变化。0.3% NaCl浓度下,接菌处理净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均大于CK组。

图4 NaCl胁迫下接种DSE对白皮松光合参数 Pn、Gs、Tr、Ci的影响Fig.4 Effects of DSEs inoculation on photosynthetic parameters Pn,Gs,Tr and Ciof P. bungeana under NaCl stress

对于白皮松胞间CO2浓度,在0%和0.1% NaCl浓度下接种Av菌株白皮松低于其余组;在0.2% 和0.3% NaCl浓度下,接菌处理胞间CO2浓度均显著高于CK组。

2.5 接种DSE对NaCl胁迫下白皮松叶绿素荧光参数的影响

ABS/RC表示单位PSII中反应中心吸收的光能。如表1所示,在0%和0.1% NaCl浓度下,CK组ABS/RC值均高于接菌白皮松;在0.2% NaCl浓度下,相较于CK组,接种Pr、Pm、Av菌株的白皮松ABS/RC值分别降低25%、11%、35%;在0.3% NaCl浓度下,未接菌白皮松ABS/RC值进一步提高,达到9.86。

表1 NaCl胁迫下接种DSE对白皮松叶绿素荧光参数的影响

TRo/RC指单位反应中心捕获的用于还原 QA的光能。随着NaCl胁迫增强,接种Pr、Pm、Av菌株的白皮松TRo/RC值整体上呈上升趋势。CK组和接种At菌株的白皮松TRo/RC值呈先上升后下降趋势,分别在0.1%和0.2% NaCl浓度达到最高值,分别为2.02和2.13。

ETo/RC是指单位反应中心捕获的用于电子传递的光能。在0% NaCl浓度下,CK组ETo/RC值是接种At菌株的1.14倍,而与其他接菌处理无显著差异;在0.1% NaCl浓度下,CK组ETo/RC值均高于接菌白皮松;在0.2% NaCl浓度下,接种白皮松ETo/RC值相比CK组差异不显著;在0.3% NaCl浓度下,接种Pr、Pm、Av菌株的白皮松ETo/RC值显著高于CK组。

DIo/RC是单位反应中心耗散掉的能量。NaCl胁迫增加使得白皮松DIo/RC值均呈升高趋势。在0%和0.1% NaCl浓度下,CK组DIo/RC值均高于接菌白皮松;在0.2% NaCl浓度下,CK组DIo/RC值分别是接种Pr、Pm、Av菌株白皮松的1.9、1.2、2.07倍,但与接种At菌株的白皮松无显著差异;在0.3% NaCl浓度下,CK组DIo/RC值分别是接菌白皮松的7.42、6.81、4.69、7.29。

2.6 接种DSE对NaCl胁迫下白皮松离子含量的影响

2.6.1 对Na+含量的影响由图5可知,白皮松地上部分Na+含量在0% NaCl浓度下,除接种Pr菌株显著高于CK组外,其余处理无显著差异。在0.1% NaCl浓度,接菌处理白皮松地上部分Na+含量均高于CK组;在0.2% NaCl浓度下,接种Av菌株的地上部分白皮松Na+含量显著低于CK组;在0.3% NaCl浓度下,接种Pm、At、Av菌株的白皮松地上部分Na+含量显著降低,分别下降34.0%、26.6%、26.3%。在0.3% NaCl浓度下,接种Pm、Av菌株的白皮松地下部分Na+含量显著低于CK组,分别下降24.4%和26.6%,其余NaCl浓度接菌与CK组Na+含量无显著差异。

图5 NaCl胁迫下接种DSE对白皮松Na+含量的影响Fig.5 Effects of DSEs inoculation on Na+content of P. bungeana under NaCl stress

2.6.2 对K+含量的影响如图6所示,白皮松地上部分K+含量,除0.1% NaCl浓度下,接种Pr菌株的白皮松K+含量显著高于CK组外,其余处理均无显著差异。在0.2% NaCl浓度下,接菌处理的白皮松地下部分出现显著提高,分别增加42.9%、58.99%、56.96%、55.92%;在0.3% NaCl浓度下,接菌白皮松K+含量高于CK组,其中接种At菌株差异显著。

图6 NaCl胁迫下接种DSE对白皮松K+含量的影响Fig.6 Effects of DSEs inoculation on K+ content of P. bungeana under NaCl stress

2.6.3 对K+/Na+比的影响由图7可知,在0%和0.1% NaCl浓度下,CK组白皮松地上部分K+/Na+比值高于接菌白皮松;但在0.2% NaCl浓度下,接种Pr、Pm、Av菌株的白皮松K+/Na+比值相较于CK组有所提高,但变化不显著;在0.3% NaCl浓度下,接种Pm、At、Av菌株的白皮松K+/Na+比值高于CK组,分别提高64.2%、35.3%、21.8%。在0% NaCl浓度下接种At菌株白皮松K+/Na+比值显著高于CK组,提高31.8%;在0.1% NaCl浓度下,接菌处理与CK组无显著差异;在0.2% NaCl浓度下,接菌处理K+/Na+比值均显著高于CK组,分别提高77.5%、67%、60.3%、70.2%;在0.3% NaCl浓度下,接菌处理K+/Na+比值高于CK组,其中接种Pm和Av菌株显著提高。

图7 NaCl胁迫下接种DSE对白皮松K+/Na+比含量的影响Fig.7 Effects of DSEs inoculation on K+/Na+ of P. bungeana under NaCl stress

3 讨论

3.1 接种DSE对NaCl胁迫下白皮松生长的影响

DSE真菌能在多样的环境中同植物形成共生关系,魏苗[10]对盐胁迫下黑枸杞DSE真菌资源的耐盐性研究中发现,在9 g/kg NaCl处理组的DSE定殖率显著高于3和6 g/kg NaCl处理组,DSE真菌微菌核和菌丝中产生的黑色素、糖原、蛋白质等物质能提高菌丝的萌发和生长,有利于帮助寄主提高抗逆性。本研究中取得了一致的结果,随着盐胁迫增强,DSE菌株的侵染率显著提高,说明适度的胁迫有助于提高DSE菌株侵染率。

DSE真菌对寄主抗逆性提高的直接作用即体现在对寄主植物生物量的影响。石志刚等[25]发现LBF-2和LBF-27 DSE真菌的‘宁杞1号’枸杞相较于对照组果实重量提高10.53%～24.56%。刘加强等[26]发现接种高粱细基格孢菌(Ulocladiumsorghi)的玉米能显著增加地下干质量,而在5、10 mg/kg Cd质量浓度下,丛赤壳菌(Neonectriaradicicola)和根异茎点霉菌(Phomaradicina)的玉米地上干质量有显著提升。在本研究中盐胁迫使得白皮松生物量整体均呈下降趋势,但接种DSE真菌可减缓下降趋势,在0.3% NaCl浓度下尤为显著,表明接种DSE有助于植株提高对NaCl胁迫的抗性,提高白皮松生物量。

3.2 接种DSE对NaCl胁迫下白皮松光合的影响

叶绿素是植物光合作用所必需的色素,其含量的变化直接影响光合作用[27-28]。在本研究中,接种DSE真菌在各盐浓度胁迫下均显著提高白皮松叶绿素含量,表明接种DSE真菌能促进叶绿素的合成,这与以往研究结果一致。盐胁迫下,植物光合作用主要受气孔因素和非气孔因素影响,在外界胁迫程度较轻的情况下,气孔因素影响光合作用较大,当胁迫程度加深则以非气孔因素为主[29-31]。本研究中,接种白皮松的净光合速率均高于CK组,表明接种DSE真菌促进了白皮松的光合作用。但随着盐胁迫增加,接菌与CK组的白皮松净光合速率、气孔导度和蒸腾速率呈下降趋势;CK组胞间CO2浓度在0%～0.1% NaC胁迫下,胞间CO2浓度升高,而在0.2% NaCl下出现下降,这可能与植物长时间受到盐胁迫作用有关。净光合速率降低而胞间CO2浓度升高,表明盐胁迫使白皮松光合作用主要受到了非气孔因素的影响,而CK组胞间CO2浓度比接种白皮松下降更早,可能因植株受损更严重所致,葛晋金等[32]的研究也得到了胞间CO2浓度下降的研究结果,他们认为这可能与钾离子的缺乏有关,本研究中接种DSE真菌则缓解了植株受到的伤害。

3.3 接种DSE对NaCl胁迫下白皮松叶绿素荧光参数的影响

叶绿素荧光参数可以反映植物光合作用PSⅡ阶段对光能的吸收利用和转化分配能力[33]。研究表明植物受到盐胁迫后,会导致ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC值升高,而ETo/RC值下降,使得PSⅡ潜在活性中心受损[34-36]。在本研究中,NaCl胁迫使白皮松单位反应中心吸收的光能(ABS/RC)、热耗散掉的能量(DIo/RC)整体呈上升趋势,但在各盐浓度下接菌处理的白皮松各值显著低于CK组;接种Pr、Pm、Av菌株的白皮松单位反应中心捕获的用于还原QA的光能(TRo/RC)整体呈上升趋势,CK组和接种At菌株的白皮松呈先上升后下降趋势,猜测可能由于NaCl造成植株受损严重所致;接菌白皮松用于传递电子的能量(ETo/RC)变化幅度小,而CK组下降显著。以上结果表明盐胁迫使得白皮松光合反应中心受到损伤,用于还原QA的能量降低,电子传递的能量减少,同时热耗散增加,导致光合作用能力下降,但相对于CK组,接菌处理能缓解光合反应中心受到损伤,其中接种Pr、Pm、Av菌株缓解的效果相对于At菌株较好。

3.4 接种DSE对NaCl胁迫下白皮松离子含量的影响

盐胁迫下,Na+的过度积累会造成K+含量的降低[37]。但接种DSE真菌有利于改善植株K+含量。侯立峰[21]研究表明,随NaCl浓度的增加,油蒿地上油松Na+/K+比值逐渐上升,接种DSE真菌能促进K+吸收,显著降低油蒿地下Na+/K+比值,提高油蒿耐盐性。在本研究中,白皮松植株中Na+含量随盐胁迫的增加而增加,K+/Na+比值显著下降,表明Na+的积累破坏了白皮松的离子稳态。在0.3% NaCl浓度,接种Pm、Av菌株的白皮松Na+含量显著低于CK组,表明接种Pm、Av菌株可能有利于减轻NaCl胁迫对白皮松的伤害;在0.1% NaCl浓度下接种Pr菌株,白皮松地上部分K+含量得到显著提高,而在0.2%和0.3% NaCl浓度,接种DSE真菌的白皮松地下部分K+含量相较于CK组均有所提高。这也导致接菌白皮松在0.2%、0.3% NaCl浓度下K+/Na+比值相较于未接菌白皮松有所提高,表明接种DSE真菌有利于帮助提高寄主植物对K+的吸收,缓解因K+和Na+竞争而导致的离子稳态失衡。