川陈皮素对食管癌KYSE150细胞存活、侵袭和凋亡的影响及机制实验研究

万传科,王晓霞,张彦青,李守霞,闫建军,王志刚

(1.邯郸市中心医院检验科,河北 邯郸 056000;2.邯郸市中心医院中医科,河北 邯郸 056000)

食管癌在组织病理学上主要分为腺癌和鳞状细胞癌两种类型[1-2]。食管腺癌在西方国家迅速增长,但我国大多数患者被诊断为食管鳞状细胞癌[3-4]。目前的外科手术和药物治疗很少能有效治疗晚期食管癌,故患者5年生存率极低[5]。食管癌通常对化学治疗药物不敏感,且不良反应较多。植物来源的天然产物在癌症治疗研究领域发挥着重要作用,如长春新碱、紫杉醇和喜树碱衍生物等,是目前许多抗癌药物的来源[6]。作为一种从陈皮中分离出来的多甲氧基黄酮类化合物,川陈皮素可抑制肿瘤细胞增殖,调节癌症发生和发展[7]。川陈皮素对癌细胞(如结肠癌、胃癌、肝癌等)的增殖均有较好的抑制作用[8],但对食管癌细胞作用的研究较少。研究[9-10]表明,Ras同源基因家族成员A(Ras homologous gene family member A,RhoA)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(Rho associated curly helix protein kinase,ROCK)是与细胞形态维持、平滑肌收缩相关的信号通路。ROCK有ROCK1和ROCK2两种亚型,均为RhoA下游效应器,在细胞增殖、凋亡和分裂中发挥重要作用[11]。本研究拟基于RhoA/ROCK信号通路探究川陈皮素对食管癌KYSE150细胞存活、凋亡和侵袭的影响,为川陈皮素的应用和食管癌的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 人食管癌KYSE150细胞(批号:KH40219)购自广东环凯生物科技有限公司。

1.2 主要试剂 川陈皮素(批号:HA18202,原料药,纯度≥98.5%)、顺铂(批号:HA19245,原料药,纯度≥99.15%)购自杭州华安生物技术公司;胎牛血清、RPMI1640培养基、TRIzol试剂、PCR试剂盒、BCA试剂盒(批号:YM10585、YM25440、YM48450、YM28500、YM21540)购自广州益满生物科技公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒、结晶紫染液、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒、反转录试剂盒、蛋白裂解液、ECL试剂(批号:DS34788、DS12628、DS23551、DS33701、DS15210、DS41175)购自广州东盛生物科技公司;兔源RhoA、ROCK1、ROCK2、GAPDH一抗、羊抗兔二抗(批号:AT11589、AT24900、AT25480、AT35819、AT42881)购自深圳安提生物科技公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养:用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基在37 ℃、5% CO2条件下培养KYSE150细胞。每24 h更换1次细胞培养液,选择对数生长期的KYSE150细胞进行实验。

1.3.2 分组与处理:将KYSE150细胞以5×104个/ml接种于96孔板中(200 μl/孔),分为对照组、顺铂组、川陈皮素低、中、高浓度组。对照组常规培养KYSE150细胞。顺铂组在含KYSE150细胞的培养基中加入0.5 μg/ml顺铂[12]。川陈皮素低、中、高浓度组在含KYSE150细胞的培养基中分别加入10、20、40 μg/ml川陈皮素[13]。上述各组每孔设6个平行样,继续培养72 h。

1.3.3 KYSE150细胞存活率检测:将各组细胞以1×104个/孔接种在96孔板中,培养48 h后加入MTT,37 ℃继续培养4 h。离心弃上清,加入二甲基亚砜200 μl/孔,振荡10 min。酶标仪测量490 nm处的吸光度(OD),计算各组KYSE150细胞的存活率。KYSE150细胞存活率(%)=实验组OD490/对照组OD490×100%。

1.3.4 KYSE150细胞侵袭能力检测:在Transwell小室的上室中添加基质胶,常温下固化4 h。在上室中添加1×105个KYSE150细胞,下室中添加RPMI1640培养基。孵育48 h后,4%多聚甲醛固定,0.1%结晶紫染色,显微镜观察并拍照(随机选6个视野),计算KYSE150细胞侵袭数目。

1.3.5 KYSE150细胞凋亡率检测:将各组KYSE150细胞重悬为1×104个/ml,加入Annexin V-FITC和PI,避光孵育25 min。采用流式细胞仪检测KYSE150细胞凋亡率。

1.3.6 KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达检测:使用TRIzol试剂提取细胞总RNA,反转录合成cDNA。以GAPDH为内参,引物由江西瑞威尔生物科技有限公司设计合成,序列见表1。荧光定量PCR反应条件:96 ℃预变性4 min;96 ℃变性16 s,68 ℃退火19 s,73 ℃延伸27 s,共33个循环。以2-ΔΔCt法分析RhoA、ROCK1和ROCK2 mRNA相对表达量。

表1 各基因引物序列

1.3.7 KYSE150细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达检测:将各组细胞用蛋白裂解液裂解,BCA试剂盒定量总蛋白。电泳分离各组中等量蛋白质后转膜,5%脱脂牛奶室温下封闭1 h,加入兔源RhoA(1∶570稀释)、ROCK1(1∶660稀释)、ROCK2(1∶800稀释)、GAPDH(1∶1250稀释)一抗,4 ℃下孵育过夜。加入羊抗兔二抗(1∶2450稀释),室温下孵育1 h,加入ECL试剂显色。蛋白条带灰度值采用Image J软件分析,然后计算RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白相对表达量(以GAPDH为内参)。

2 结 果

2.1 川陈皮素对KYSE150细胞存活率及侵袭能力的影响 见表2(图1)。与对照组比较,顺铂组及川陈皮素低、中、高浓度组KYSE150细胞存活率和侵袭数目降低(均P<0.05)。与顺铂组比较,川陈皮素低、中浓度组KYSE150细胞存活率和侵袭数目升高(均P<0.05)。而川陈皮素高浓度组与顺铂组KYSE150细胞存活率和侵袭数目比较差异无统计学意义(均P>0.05)。川陈皮素低、中、高浓度组KYSE150细胞存活率和侵袭数目依次降低(均P<0.05)。

图1 各组KYSE150细胞结晶紫染色结果(×200)

表2 川陈皮素对KYSE150细胞存活率及侵袭能力的影响

2.2 川陈皮素对KYSE150细胞凋亡率的影响 见图2。对照组、顺铂组以及川陈皮素低、中、高浓度组KYSE150细胞凋亡率分别为(6.48±1.16)%、(27.69±5.05)%、(12.65±2.61)%、(18.16±2.75)%、(27.35±4.54)%。与对照组比较,顺铂组及川陈皮素低、中、高浓度组KYSE150细胞凋亡率升高(均P<0.05)。与顺铂组比较,川陈皮素低、中浓度组KYSE150细胞凋亡率降低(均P<0.05)。而川陈皮素高浓度组与顺铂组KYSE150细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。川陈皮素低、中、高浓度组KYSE150细胞凋亡率依次升高(均P<0.05)。

图2 各组KYSE150细胞凋亡流式细胞仪检测结果

2.3 川陈皮素对KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达的影响 见表3。与对照组比较,顺铂组及川陈皮素低、中、高浓度组KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达水平降低(均P<0.05)。与顺铂组比较,川陈皮素低、中浓度组KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达水平升高(均P<0.05)。川陈皮素高浓度组与顺铂组KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达水平比较差异无统计学意义(均P>0.05)。川陈皮素低、中、高浓度组KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达水平依次降低(均P<0.05)。

表3 川陈皮素对KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达的影响

2.4 川陈皮素对KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达的影响 见表4。与对照组比较,顺铂组及川陈皮素低、中、高浓度组KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达水平降低(均P<0.05)。与顺铂组比较,川陈皮素低、中浓度组KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达水平升高(均P<0.05)。川陈皮素高浓度组与顺铂组KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达水平比较差异无统计学意义(均P>0.05)。川陈皮素低、中、高浓度组KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达水平依次降低(均P<0.05)。

表4 川陈皮素对KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达的影响

3 讨 论

食管癌是食管上皮细胞的恶性肿瘤,受遗传、吸烟及不良饮食习惯等因素影响。食管癌可能导致患者出现饮食吞咽困难,引发一系列并发症,甚至死亡[14]。食管癌病死率较高,发病隐匿,许多患者发现时已处于疾病晚期,化疗常常成为主要治疗措施[15]。同时,由于合成的抗肿瘤药物对本病的治疗效果较差,许多食管癌患者会出现肿瘤耐药以及肿瘤复发,因此越来越多学者转向天然抗癌活性药物的研究[16-17]。

川陈皮素具有抗癌、抗血栓、抗炎等方面的作用,在多种肿瘤的治疗中具有重要的辅助作用。YOU等[18]报道,川陈皮素能够通过抑制糖原合成酶激酶-3β来抑制胆管癌的增殖和集落形成。ZHANG等[19]研究表明,川陈皮素能够降低线粒体膜电位,显著减弱卵巢癌细胞增殖活性,促进凋亡。SOUSA等[20]发现,川陈皮素能够单独或和顺铂联合使用降低间变性甲状腺癌细胞的活力,同时对正常甲状腺细胞的毒性较小。WANG等[21]研究发现,川陈皮素可促进乳腺癌细胞焦亡,从而抑制乳腺癌肿瘤进展,有望成为治疗乳腺癌的新药物。本研究使用川陈皮素处理食管癌KYSE150细胞,结果发现低、中及高浓度川陈皮素处理后的KYSE150细胞存活率、侵袭数目较对照组显著降低,凋亡率显著升高,且呈现剂量依赖性,与上述报道结果一致[18-21]。表明川陈皮素能够抑制KYSE150细胞的存活和侵袭,促进细胞凋亡,影响KYSE150细胞生物学行为。

作为与肿瘤进展关系密切的通路,RhoA/ROCK可影响癌细胞生物学行为[22-23]。研究[24]发现,实肌球蛋白磷酸酶靶亚基1能够通过降低RhoA/ROCK信号通路活性,使得结直肠癌细胞的增殖和迁移能力降低。李登辉等[25]研究表明,激活RhoA/ROCK信号通路能够促进喉癌细胞的增殖、侵袭和上皮间质转化。LI等[26]报道,降低RhoA/ROCK通路活性能够抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。有研究[27]报道,RhoA/ ROCK信号通路的激活会促进卵巢癌转移,导致卵巢癌患者不良预后的发生,而沉默RhoA/ ROCK信号通路会减弱卵巢癌细胞活性,阻碍卵巢癌的进展。本研究发现,低、中及高浓度川陈皮素处理后的食管癌KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白表达水平显著降低,且呈现剂量依赖性。结合唐军伟等[24]、LI等[26]和WEI等[27]的研究,我们认为川陈皮素抑制KYSE150细胞的存活和侵袭,促进其凋亡的机制可能与抑制RhoA/ROCK信号通路的激活有关。可能原因为川陈皮素干预后导致RhoA/ROCK通路活性降低,进而影响KYSE150细胞生物学行为,抑制其恶性进展。

综上所述,川陈皮素能抑制KYSE150细胞存活和侵袭,促进凋亡,其机制可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。本研究不足之处,在于仅探究了川陈皮素通过RhoA/ROCK通路对食管癌KYSE150细胞生物学行为的调控作用,川陈皮素能否通过其他信号通路抑制KYSE150细胞的存活和侵袭,促进凋亡,有待进一步研究。