中性粒细胞外诱捕网在肝细胞癌转移中的作用机制及应用价值研究进展

吴颖升,梁向娟,彭嘉敏,黄晶晶,2,RASSUL(哈萨克斯坦)

(1.广西中医药大学,广西 南宁 530023;2.广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023;3.陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046)

肝癌是世界常见的恶性肿瘤之一,肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌(Primary liver cancer, PLC)中最常见的类型[1]。手术切除是目前HCC治疗的重要手段,但是术后高复发和高转移成为了影响患者5年生存率的主要因素,目前我国肝癌晚期患者5年生存率仍在20%以下,即使是直径小于3 cm的亚临床肝癌患者,肝切除术后5年复发率也高达43.5%[2]。肝癌转移是由肝癌细胞与肿瘤微环境间相互作用,通过炎症浸润、免疫抑制、新血管和淋巴等途径进行转移,其潜在分子机制仍未完全了解。为此,阐明肝癌转移的分子调控机制,挖掘其潜在治疗靶标在降低肝癌转移率及提高患者5年生存率上有着深远的意义。

中性粒细胞是先天免疫系统中最丰富的效应细胞,是不同类型肿瘤内的主要组成部分,在癌症转移和患者预后中发挥重要作用[3-4],肝癌中的可溶性因子诱发中性粒细胞中功能性自噬相关因子微管相关蛋白1轻链3 (Microtubule-associated protein1 light chain 3,MAP1LC3)和自噬体的显著增加,从而促进HCC转移,与中性粒细胞直接相关并共同存在于肿瘤炎症微环境中的中性粒细胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps,NETs)同样被证实与肿瘤进展及转移有关[5-6],并成为近几年的研究热点。

1 中性粒细胞与NETs

中性粒细胞是重要的固有免疫细胞,其免疫功能包括吞噬作用、活性氧(ROS)产生、脱颗粒以及NETs形成与释放[7]。中性粒细胞产生NETs的方式有两种[8]:一种是自杀式NETosis,另一种是活力型NETosis。这两种途径在诱导因子、释放方式和形成后中性粒细胞特征等方面存在差异,自杀式NETosis主要由宿主自身抗体和免疫因子诱发以穿透包膜的方式释放,释放后中性粒细胞死亡。活力型NETosis由生物因子诱发以囊泡出芽形式释放胞外,形成后中性粒细胞核膜完整,吞噬功能正常。NETs在2004年被BRINKMANN 等[9]发现并命名,并明确其是由中性粒细胞受到各种因素释放,途径是还原辅酶I(NADH)激活Raf/Merk/ErK信号通路的氧化反应,其结果是构成由线粒体DNA为主体,由组蛋白与颗粒蛋白修饰的立体网状结构。NETs的成分髓过氧化物酶(MPO)和防御素具有抗病毒作用,能抑制病毒活性,还能通过NADPH氧化酶产生的ROS、肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)、中性粒细胞弹性蛋白(NE)和染色质的脱缩来杀死病原体[10-12]。这些作用的前提是NETs的表达在未失调的范围。相反,如果NETs失调,就会引起组织损伤并促进免疫相关疾病的发病,如NETs会导致所有形式的血栓形成、微粒诱导的炎症、自身免疫性血管炎、自身炎症性疾病以及缺血性、毒性或创伤性组织损伤引起的继发性炎症[13]。近年来,已有大量动物模型和肿瘤患者数据表明,NETs参与了肿瘤的进展和转移。NETs在肿瘤中发挥的潜在生物学作用逐步被发掘,包括肿瘤的发生、进展、转移及对治疗药物的耐药性等。

2 HCC转移与NETs

肝脏疾病进展为HCC需经历三个阶段,首先是由不良生活方式引发的脂肪肝后发展为肝炎,继而导致部分肝脏发生肝硬化,最后演变为HCC,其中有很大一部分患者从代谢性脂肪性肝炎(NASH)直接进展为HCC,没有经历肝硬化这一过程[14],这表明了炎症在癌症发生和发展过程中的重要性[15]。DIR等[16]研究发现,通过建立C57BL/6小鼠STAM-NASH模型,在造模第5周出现中性粒细胞浸润,至第20周所有模型小鼠进展为HCC,且在肝脏组织切片中观察到NETs特异性标志物瓜氨酸化组蛋白H3(cit-H3)的表达,这表明中性粒细胞参与了NASH的过程并产生了NETs,NETs又促进NASH进展为HCC。应用脱氧核糖核酸酶(DNase)给药治疗与敲除PAD4后,STAM-NASH模型小鼠肝脏表面肿瘤体积变小及数量减少,证明靶向NETs能减缓NASH向HCC进展。YANG等[17]通过免疫荧光染色直接观察HCC患者肝脏组织中cit-H3和MPO的表达来证明HCC微环境中的中性粒细胞能够形成NETs。此外,具有高转移潜力的HCC细胞可以通过一些分泌因子诱导正常的中性粒细胞形成NETs。

NETs能促进HCC的生长和转移。在HCC组织中产生的缺氧环境可以引起细胞坏死后释放损伤相关分子模式(DAMPs)相关分子,如高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和线粒体DNA(mtDNA)。这些DAMPs分子与其受体相互作用,触发促炎信号级联反应,导致肿瘤进展。HMGB1通过介导mtDNA和Toll样受体-9 (TLR9)的结合以及随后促肿瘤信号通路的激活,在缺氧期间的TLR9激活中起关键作用[18],被激活的TLR9在HCC中过表达并促进缺氧引起的HCC进展。为了证实缺氧环境引起的TLR9与NETs的形成有关,TOHME等[19]通过诱导小鼠缺氧,并将缺氧小鼠的中性粒细胞与佛波酯(PMA)处理的中性粒细胞进行对比,结果显示两者NETs形成显著增加,如免疫荧光染色中cit-H3表达增加;同样,在配对的人转移性结直肠癌组织样本及其相应的非肿瘤肝组织中,缺氧诱导因子1 α(HIF-1α)和cit-H3在复发性转移性结直肠癌肿瘤中的表达更高。这些结果表明,在生长中的肿瘤中存在的缺氧环境中,手术应激后NETs形成急剧增加。通过评估1985至2011年的2019例行肝切除手术的HCC患者的HCC组织cit-H3的表达,发现在患有门静脉肿瘤血栓形成或肝外转移的HCC患者组织标本中观察到的cit-H3表达明显更强于没有转移的HCC[20]。JIANG等[21]发现中性粒细胞释放NETs的浸润水平与患者生存呈负相关,与HCC患者肿瘤转移电位呈正相关。该研究组从能量代谢的角度探索发现糖酵解的上调通过NADPH氧化酶-ROS途径在这些细胞中触发了NETs的释放。随着NETs在肝移植领域的研究的深入,多项研究发现,DAMPs包括HMGB1和肝脏缺血再灌注损伤过程中释放的组蛋白或超氧化物,与NETs的形成有关,NETs促进库普弗细胞M1极化和HMGB1加重肝脏缺血再灌注的细胞内易位,甚至导致肝移植后急性移植排斥反应[22]。GUAN等[23]通过评估2019例肝切除术患者获得了cit-H3在HCC组织中沉积的组织学证据,表明在患有门静脉癌栓或肝外转移的HCC患者组织标本中观察到的cit-H3表达明显更强于无转移者,为了进一步评估组织微环境中NETs的存在是否与疾病预后相关,分析了相同的80组组织标本cit-H3水平与存活率间的相关性,结果表明cit-H3组织表达较高的患者生存率较低。这些研究结果表明NETs与HCC转移相关,大多经过反复的炎症反应促进细胞增殖、新血管生成、上皮细胞间充质转化和细胞外基质降解。

2.1 NETs促进HCC血管生成 HCC是典型的多血供肿瘤,血管生成在HCC生长和转移中均起到重要作用。血管的生成是一个复杂的形态学过程,受促血管生成因子群和抗血管生成因子群的调控,血管内皮生长因子(VEGF)是重要的促血管生成因子,炎性反应中环氧化酶-2(COX-2)能刺激VEGF过表达[24]。COX-2是肿瘤炎症微环境成分,可被炎症因子激活。中性粒细胞聚集和NETs形成可以调节关节炎等炎症性疾病中的COX-2[25]。ZHAO等[26]通过体内与体外实验发现,使用COX-2抑制剂减少HCC细胞COX-2的表达,与来自未经处理的HuH-7细胞相比,处理后的HuH-7细胞抑制了人体外脐静脉内皮细胞和血管的生成,作用机制是下调促血管生成因子如VEGF、肝细胞生长因子(HGF) 、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、血管生成素1(Ang-1)和血管生成素2(Ang-2)在HCC中的表达。NETs还能通过Toll样受体2(TLR2)激活COX-2从而增强肿瘤的转移[27]。YANG等[17]还发现,NETs可以通过激活TLR4/9-COX-2信号通路诱导炎症反应,释放细胞因子和趋化因子吸引免疫细胞释放生长因子和蛋白酶,诱导血管生成,促使HCC发生转移。NETs的主要成分组蛋白是其促进血管生成的另一重要原因。NETs能够通过相关的蛋白酶[如基质金属蛋白酶9(MMP-9)、NE] 溶解胞外基质 (ECM),从而释放 VEGF[28],以提高肿瘤侵袭和血管生成的能力。在临床实验研究中,手术引发的缺血再灌注损伤能够通过上调HCC组织中VEGF表达使肿瘤转移的可能性增加,近年体内动物实验[29-30]也证实大肠癌肝转移模型小鼠血清比正常小鼠血清的HGF、VEGF水平升高,其机制与促血管生成因子促进肿瘤血管生成相关。JUNG等[31]将内皮细胞与不同浓度组蛋白共同培养4 h后置于显微镜下观察毛细血管状结构的生成,用Image J软件分析血管的大小与长短,为了确认结果的特异性,设立组蛋白抑制剂肝素和PSA[32-33]与内皮细胞共同培养,后将结果进行对照,抑制剂组血管生成减少,其原理在于阴离子属性抑制剂与带正电荷组蛋白结合使其活性降低。NETs还通过激活和清除衰老内皮细胞以及进一步上调促血管生成因子来促进血管生成。癌前衰老细胞促进肿瘤转移与其不稳定的基因组和失调的微环境引发慢性炎症形成的促瘤环境有关。癌前衰老肝细胞免疫监测受损导致鼠HCC的进展[34],对含有癌前衰老肝细胞的小鼠肝脏的显微镜影像显示,在形态学改变的衰老肝细胞周围有大量免疫细胞的炎症反应,炎症趋化因子刺激促血管生成因子导致血管生成。

2.2 NETs诱导HCC细胞上皮间充质转化 上皮细胞间充质转化(EMT)是癌症侵袭性转移播散的关键过程,其经历从上皮到间充质表型的多种动态过渡状态,特征在于上皮细胞标志物如细胞角蛋白(CK)和钙黏附蛋白E(E-Cad)缺失,间充质细胞标志物如钙黏附蛋白N (N-cadherin)、波形蛋白和纤连蛋白(FN)的表达上调。许多数据证实NETs促进肿瘤EMT的形成,进而导致肿瘤的侵袭与转移,在结肠癌[35]、胃癌[36]、乳腺癌[37]等中都有发现NETs通过EMT促进了肿瘤转移。炎症反应促进EMT的形成,NETs与炎症反应的关系密切。当HCC细胞发生EMT时,HCC细胞失去上皮细胞的特性,转化为具有迁移侵袭能力的间质细胞特性,在EMT转化过程中发生了明显的细胞骨架重建,改变多种与EMT相关的转录因子、细胞表面受体的表达。JIN等[37]研究发现,NETs通过白介素-1β(IL-1β )/ EGFR/ERK途径促进癌细胞中的EMT。NETs能通过激活Ras/Raf/Mek/Erk信号通路,上调促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β及肿瘤坏死因子-α (TNF-α)的表达[38],在肿瘤与正常组织间持续招募免疫细胞,如巨噬细胞和肥大细胞,从而形成炎性肿瘤微环境。由于慢性炎症产生的炎性胞因子失衡及对免疫系统的抑制作用,细胞因子通过降解基底膜和细胞外基质成分为肿瘤离开基底膜、浸润和转移到正常组织创造了条件,有助于肿瘤细胞离开原发肿瘤部位,向局部正常的外周组织浸润、侵袭。细胞因子还可通过相应的受体激活不同的信号传导通路,诱导EMT的形成。LIN等[39]通过对系统性红斑狼疮与COVID-19进行转录分析,明确NETs通过上调EMT关键转录因子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Twist、Snail蛋白表达同时降低EMT特征性分子E-cadherin蛋白表达来促进EMT。WANG等[40]研究表明NETs通过下调miR503HG表达激活NF-κB/NLRP3通路,促进EMT和肺癌转移。

ZHAN等[41]通过实验验证了HCC、NETs和EMT三者的关系,NETs刺激导致上皮标志物E-cadherin减少和间充质标志物Vimentin增加,细胞系的侵袭性增强,侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达增加,HCC细胞被NETs包裹黏附性增强,当添加DNase I以减少NETs形成时,黏附的HCC细胞部分减少。在NETs干预30 d后NETs不仅增加了远处肺转移小鼠的数量,而且增加了肺中转移集落的数量,该研究组还通过标志物鉴定NETs的表达来确认NETs在此实验中对HCC转移干预作用的特异性。同时期HU等[42]检测通过COX-2介导EMT后HCC细胞的迁移与侵袭能力,评估HCC转移与COX-2相关,COX-2信号通路能被NETs激活,这一理论的具体机制还需更多实验数据去证实。EMT使上皮细胞失去了细胞极性,失去与基底膜的连接等上皮表型,获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。阐明调控HCC发生EMT过程的分子机制,明确其在HCC的转移中的病理意义,并探索基于EMT关键分子的诊断方法及靶向NETs关键分子的治疗手段,有助于解决HCC转移中的关键难题。

2.3 NETs降解HCC细胞外基质促进肝癌细胞浸润 ECM是肿瘤微环境的重要组成部分,由蛋白质、糖蛋白和多糖组成。ECM作为细胞因子和生长因子的储存库,具有维持组织形态并调节细胞行为的功能[43]。ECM的降解突破基底膜是肿瘤细胞侵袭转移的第一步。体内可以降解ECM的酶主要有三类:MMPs、纤维蛋白溶酶(PL)和NE,其中MMPs发挥主要作用。MMPs可以降解胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白等多种ECM组分,按照底物可分为胶原酶、明胶酶、基质溶解素和基质溶解因子。基质金属蛋白酶抑制因子(TIMPs)可以与MMPs结合并抑制其活性,从而在体内调控MMPs的ECM降解能力。NE可以独立于NETs的形成而从中性粒细胞中释放出来,同时也证明了NE在NETs的病理功能中起着重要作用。NE对于ECM的降解作用体现在其能与MMP-9依次切割层粘连蛋白[44],导致ECM结构紊乱,随着ECM紊乱的增加,高胶原和弹性蛋白纤维堆积干扰自然杀伤细胞识别肿瘤细胞,增加的促血管生成生长因子VEGF、IL-8 、血小板衍生性生长因子受体-β (PDGFR-β)、MMP-9 和 MMP-14使肿瘤供血系统和肿瘤微环境更有利于肿瘤的生长和转移。NE还参与细胞外基质重塑的炎症反应,这个过程通过水解细胞外基质片段产生中性粒细胞和单核细胞的趋化性。这种炎症反应会吸引额外的抗炎因子,从而缩短感染过程。此外,受损的基底膜释放层粘连蛋白(是各种基膜的主要成分之一)片段促进中性粒细胞迁移和抗氧化因子募集,从而加速炎症过程致肿瘤转移发生。刘立友等[45]通过对75例肝癌切除术患者的肿瘤组织层粘连蛋白3(LAMA3)的表达与血管浸润、淋巴结转移的相关研究,表明LAMA3表达升高会促进PLC转移。

在HCC中NETs通过促进MMP-2和MMP-9表达升高诱导ECM的降解,促进HCC转移[41]。在一项关于乙型肝炎介导的NETs促进HCC生长和转移的机制研究中,给予纯化NETs干预HepG2细胞48 h后检测细胞迁移和侵袭能力增强,Western bolt显示侵袭相关蛋白MMP-2与MMP-9表达量上调,纤维蛋白表达量下调,使肿瘤微环境炎症反应加重,ECM结构失调发生HCC转移。这一研究提出NETs在有乙型肝炎病史的HCC患者和预后不良的患者体内激活休眠的HCC对ECM进行重塑,使TME更适合HCC细胞的增殖。有学者基于NETs的23个主要成分基因的基因集变异分析(GSVA),计算结果分析显示,受NETs调控SPP1、MT1L和COL3A1等癌症转移相关基因的评分较高,这与ECM降解和泛癌危险因素的刺激有关,HCC是受这些基因调控的肿瘤之一。XIAO等[46]发现NETs抑制剂西维来司他钠或DNase I在动物模型上能有效减少肺癌的转移播种和定植,这是通过减弱了组织蛋白酶C(CTSC)的溶解作用,使ECM维持相对稳定的状态,从而抑制了肺转移,通过这项研究证实NETs的组分CTSG能够加快ECM降解并促进肿瘤转移。然而,对于关于NETs中的NE和其他蛋白酶在HCC中如何使ECM发生降解的直接作用机制的实验数据仍然较少,中性粒细胞相关颗粒蛋白在ECM中的影响及肿瘤转移的起始过程仍需进一步探讨。

3 靶向NETs在HCC转移治疗中的应用

目前靶向NETs的治疗关键主要在于抑制NETs的形成和促进已形成的NETs降解。破坏NETosis是抑制NETs形成的一种治疗策略。鉴于NE和PAD4在NETosis过程中的关键作用,NE抑制剂或PAD4抑制剂也常用于防止NETs的释放。氯脒是一种泛PAD抑制剂,能通过酶活性位点的共价修饰来不可逆地抑制PAD,被发现能够抑制PAD4的表达,从而预防NETosis,目前已有使用氯脒靶向干预NETs运用预防结肠炎发展为结肠肿瘤。WANG等[47]通过建立小鼠模型证实了NET与调节性T细胞在NASH中呈正相关关系,两者所塑造的免疫环境易促进NASH发展成HCC;在小鼠身上建立PAD4敲除模型能够减少小鼠体内NETs的形成,抑制调节性T细胞的活性,从而抑制NASH进展为HCC。除了氯脒,新研发的GSK484与BMS-P5在抑制NETs发展和抑制相关疾病方面的功效现已得到几项体外和体内研究[16]的证实。

NETs降解的靶向药物也得到了许多验证。DNase I 被公认为可以消化细胞外染色质和 NETs。基于NETs通过激活肿瘤炎症反应促进HCC转移的研究[21]发现,采用抗炎药物乙酰水杨酸(Aspirin)和羟氯喹(HCQ)阻断COX-2和上游TLR4/9激活与DNase I互补,并通过多个角度证明了抑制HCC转移的有效性。这些联合疗法可以阻断或消化NETs,并通过未溶解的NETs消除被捕获的HCC细胞的触发转移潜力。另一方面,DNase I在自身免疫性疾病中临床应用,毒性不大,可降解全身性LPS添加诱导的NETs大量形成,有效消除HCC的实验转移。在HCC的原位小鼠模型中采用DNase I与HCQ或Aspirin对抗NETs,发现与单独的DNase I相比,这种组合在抑制HCC的自发性肝内和肺内转移方面显示出更显著的效率[17]。在进一步评估了NETs对小鼠体内肿瘤生长的影响后发现,从健康供体的外周血中纯化中性粒细胞,并在不使用GSK2(PAD484抑制剂)干预的情况下,用HepG2人细胞系上清液处理,然后将处理后的中性粒细胞洗涤并静脉注射到具有已建立肝内HepG2肿瘤的免疫缺陷小鼠体内。如与正常中性粒细胞对照相比,用肿瘤上清液预处理的中性粒细胞在肿瘤原位释放(cit-H3信号)显著增加,诱导的肿瘤在肺部产生更多转移病灶。DNase I和PAD4均能原位拮抗肿瘤暴露-中性粒细胞治疗组cit-H3信号的上调,显著消除中性粒细胞诱导的体内肿瘤转移。相比之下,肿瘤暴露的中性粒细胞不影响肿瘤原位生长。此外,当DNase I和GSK484腹膜内注射到已确诊肝内Hepa57-6肿瘤的C1BL/6野生型小鼠中时,它们不影响体内肿瘤生长,但与对照组相比既能减少cit-H3细胞在肿瘤组织中的浸润,又能阻止肺肿瘤转移。这些数据表明,NETs可以促进小鼠体内肿瘤转移。

4 结 语

HCC炎性微环境中的癌细胞、肿瘤相关中性粒细胞和NETs形成间的相互作用关系突出了NETs在HCC转移中的作用。本文针对NETs在HCC转移中的研究进行综述,并简要总结了NETs影响HCC转移的干预方向。越来越多的证据表明,在某些癌症中,通过直接抑制或抑制上游因子的表达和活性是一种高效的治疗策略,所以抑制NETs的表达或者阻断其上游信号通路的转导有望成为HCC转移的有效靶点。因此,需要进一步研究NETs在HCC转移中的基本作用机制及其临床相关性。