紫檀芪调控微小RNA-340-5p/髓细胞白血病-1轴对胆囊癌SD细胞生物学行为的影响实验研究

王京京,李全福,张立广,邵青龙

(保定市第二医院肝胆外科,河北 保定 071000)

胆囊癌(Gallbladder cancer,GBC)是最常见的胆道癌症,因其侵袭性行为和早期缺乏有效的筛查手段,导致多数患者在诊断时已处于晚期且预后较差[1-2]。尽管少数患者可以进行根治性切除,但5年生存率仍然很低[3]。因此,寻找有效治疗药物有助于改善GBC患者预后。紫檀芪(Pterostilbene,PTS)是白藜芦醇的衍生物,从花生、葡萄、桑葚、蔓越莓、蓝莓中提取,具有抗炎、抗氧化和抗癌作用[4-5]。PTS可调控多种信号通路,抑制细胞增殖[6-8]。既往研究[9]表明,PTS可减弱GBC细胞增殖、迁移和侵袭,抑制GBC进展,其作用机制仍需更深入研究。有研究[10]显示,微小RNA(microRNA,miRNA)可调控肿瘤的发展。据报道[11],微小RNA-340-5p(microRNA-340-5p,miR-340-5p)在GBC中低表达,促进miR-340-5p表达可抑制GBC细胞增殖和侵袭并诱导细胞凋亡。髓细胞白血病-1(Myeloid cell leukemia-1,MCL-1)是B淋巴细胞瘤-2(B cell lymphoblastoma-2,Bcl-2)蛋白家族的抗凋亡蛋白,其过表达与肿瘤分级、低存活率和化疗耐药性相关[12]。研究[13]发现,在GBC中环状RNA浆细胞瘤变体易位1通过miR-339-3p上调MCL-1表达,促进GBC生长。推测PTS和miR-340-5p/MCL-1是治疗GBC的潜在药物或靶点,然而PTS对GBC细胞迁移和侵袭的影响机制是否是通过调控miR-340-5p/MCL-1轴实现尚不可知。因此,本研究基于GBC细胞系GBC-SD,探讨PTS对GBC细胞迁移和侵袭及miR-340-5p/MCL-1轴的影响,以期了解GBC的发展机制,为临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与动物 人GBC细胞系GBC-SD细胞(批号:TP-3915K)购自上海通派生物科技公司。6周龄雄性无胸腺裸鼠(体重14～16 g,SPF级)购自江苏艾菱菲生物公司,生产许可证号SCXK(苏)2022-0014,在无病原体实验室中饲养。裸鼠实验经医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 PTS(批号:SP9570,原料药,纯度≥99.15%)购自陕西慈缘生物技术公司;空载质粒、miR-340-5p小干扰RNA(siRNA)质粒、MCL-1-野生型(WT)、MCL-1-突变型(MUT)、miR-340-5p模拟物(mimics)、miR-340-5p阴性对照(miR-340-5p-NC)质粒均由上海吉玛公司合成;DMEM培养基(批号:JKR-D027)、Lipofectamine 3000试剂(批号:JKR-D016)、CCK-8试剂盒(批号:JKR-A011)、TRIzol试剂(批号:JKR-D009)、辣根过氧化物酶偶联的二抗(批号:JKR-K013)购自武汉金开瑞生物公司;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)双染试剂盒(批号:L10164)、Matrigel基质胶(批号:L19134)、PCR试剂盒(批号:L21573)、RIPA裂解液(批号:K19242)、MCL-1(批号:K25116)、Ki67(批号:K29157)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1,批号:K31548)、Bcl-2(批号:K36229)、Bcl-2相关X蛋白(Bax,批号:K70191)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3,批号:K71264)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,批号:K10135)一抗购自苏州亚凡生物公司。

1.3 实验方法

1.3.1 PTS浓度筛选:GBC-SD细胞置于10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基中进行传代培养。待GBC-SD细胞生长至对数生长期,接种于96孔板中,加入不同浓度PTS(0、5、10、20、40、80 μmol/L)孵育48 h后,加入CCK-8溶液15 μl,4 h后酶标仪检测450 nm处吸光度(OD),计算细胞存活率(各浓度PTS的OD450与0 μmol/L的OD450的比值×100%)。各浓度PTS均设8个平行样。计算PTS对GBC-SD细胞的半数抑制浓度(IC50),将接近IC50的PTS用于后续实验。

1.3.2 细胞分组与干预:在6孔板中接种对数生长期的GBC-SD细胞(2×105个/孔),将细胞分为对照组(DMEM培养基常规培养GBC-SD细胞)、PTS组(加入80 μmol/L的PTS培养GBC-SD细胞)、PTS+空载质粒组(加入80 μmol/L的PTS培养GBC-SD细胞,并转染空载质粒)、PTS+miR-340-5p沉默组(加入80 μmol/L的PTS培养GBC-SD细胞,并转染miR-340-5p siRNA质粒)。使用Lipofectamine 3000试剂转染对应的质粒。各组均设8个平行样。

1.3.3 细胞增殖检测:将各组细胞置于96孔板中,培养48 h后加入15 μl的CCK-8溶液,4 h后酶标仪检测OD450,计算细胞存活率(各干预组OD450与对照组OD450比值×100%)。

1.3.4 集落形成检测:用多聚甲醛固定在6孔板中培养2周的各组GBC-SD细胞,然后0.1%结晶紫染色,显微镜观察计数集落形成数(>50个细胞的集落)。

1.3.5 细胞凋亡检测:各组GBC-SD细胞进行48 h的培养,然后制备成细胞悬浮液。将悬浮液与10 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI在37 ℃下培养15 min,使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.6 细胞划痕实验:收集各组细胞并接种在6孔板中,待细胞融合度≥80%,用微量移液器枪头垂直划线。PBS洗涤,在DMEM培养基中继续培养48 h,显微镜下测量划痕距离并拍照,计算迁移率[(0 h划痕距离-48 h划痕距离)/0 h划痕距离×100%]。

1.3.7 细胞侵袭实验:Transwell预先涂上Matrigel基质胶,将细胞接种于Transwell小室上室,下室加完全培养基。48 h后将上室细胞去除,4%多聚甲醛固定下室侵袭细胞10 min,然后0.1%结晶紫染色5 min,显微镜下计数染色细胞数量(细胞侵袭数)。

1.3.8 miR-340-5p和MCL-1 mRNA表达检测:使用TRIzol试剂从培养48 h的各组细胞中提取RNA,并反转录合成cDNA,行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应。反应条件:在93 ℃变性12 min,然后循环34次(93 ℃ 16 s,61 ℃ 21 s,79 ℃ 27 s),67 ℃延伸4 min。扩增体系(总共30 μl)根据PCR试剂盒进行分配。引物由北京阳科华科技公司合成,序列见表1。以2-ΔΔCt法计算miR-340-5p(内参U6)和MCL-1 mRNA(内参GAPDH)的相对表达量。

表1 各基因引物序列

1.3.9 MCL-1及增殖凋亡相关蛋白检测:将培养48 h的各组细胞用预冷的RIPA进行裂解,蛋白浓度采用BCA法定量后,进行电泳分离蛋白质并转膜,室温用5%脱脂牛奶封闭1 h,将膜与MCL-1(1∶1160)、Ki67(1∶1090)、Cyclin D1(1∶1640)、Bcl-2(1∶950)、Bax(1∶950)、Cleaved caspase-3(1∶1400)、GAPDH(1∶1550)一抗孵育,4 ℃过夜,然后加二抗(1∶3100)一起孵育2.5 h,使用ECL检测试剂盒可视化,根据条带灰度值计算蛋白表达量。

1.3.10 双荧光素酶报告基因实验:将MCL-1-WT、MCL-1-MUT连接到pmir-GLO双荧光素酶载体,将构建的荧光素酶报告质粒MCL-1-WT、MCL-1-MUT在GBC-SD细胞中与miR-340-5p-NC或miR-340-5p mimics共转染48 h,荧光素酶活性采用双荧光素酶报告检测系统测定。

1.3.11 体内肿瘤移植实验:使用6周龄雄性无胸腺裸鼠进行体内研究。取100 μl含有GBC-SD细胞(1×104个)的细胞液经皮下注射所有裸鼠体内。7 d后,将裸鼠分为模型组和PTS组,每组10只。模型组裸鼠灌胃40 mg/kg 0.9%氯化钠溶液,PTS组裸鼠灌胃40 mg/kg的PTS[14],每天1次,连续4周。分别于造模成功后(GBC-SD细胞液100 μl皮下注射裸鼠体内7 d后)、给药4周后测量裸鼠肿瘤体积。给药4周后处死裸鼠分离肿瘤并测量肿瘤重量。取肿瘤组织将其匀浆化,参照上述RT-qPCR和蛋白印迹实验检测肿瘤组织中miR-340-5p、MCL-1 mRNA和蛋白表达。

2 结 果

2.1 PTS浓度筛选结果 0、5、10、20、40、80 μmol/L PTS浓度下的GBC-SD细胞存活率依次为(100.00±0.00)%、(91.37±5.12)%、(79.51±8.09)%、(70.23±6.18)%、(61.49±7.38)%、(50.78±6.77)%。随着PTS浓度的升高,GBC-SD细胞存活率逐渐降低(均P<0.05)。经计算,IC50为74.31,因此本研究选择80 μmol/L的PTS进行后续实验。

2.2 各组GBC-SD细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力比较 见表2。与对照组比较,PTS组细胞存活率、集落形成数、迁移率、细胞侵袭数降低,细胞凋亡率升高(均P<0.05);与PTS组和PTS+空载质粒组比较,PTS+miR-340-5p沉默组细胞存活率、集落形成数、迁移率、细胞侵袭数升高,细胞凋亡率降低(均P<0.05)。

表2 各组GBC-SD细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力比较

2.3 各组GBC-SD细胞miR-340-5p、MCL-1 mRNA和蛋白及增殖凋亡相关蛋白表达比较 见表3。与对照组比较,PTS组miR-340-5p、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达升高,MCL-1 mRNA和蛋白、Ki67、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达降低(均P<0.05)。与PTS组和PTS+空载质粒组比较,PTS+miR-340-5p沉默组miR-340-5p、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达降低,MCL-1 mRNA和蛋白、Ki67、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达升高(均P<0.05)。

表3 各组GBC-SD细胞miR-340-5p、MCL-1 mRNA和蛋白及增殖凋亡相关蛋白表达比较

2.4 miR-340-5p与MCL-1的靶向关系 见表4。Star Base数据库预测显示,miR-340-5p与MCL-1存在结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-340-5p mimics和MCL-1-WT共转染的细胞荧光素酶活性较miR-340-5p-NC和MCL-1-WT共转染降低(P<0.05)。

表4 荧光素酶活性比较

2.5 PTS干预后对裸鼠肿瘤生长及miR-340-5p/MCL-1轴的影响 见表5。模型组和PTS组造模成功后肿瘤体积比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较,PTS组给药4周后肿瘤体积、给药4周后肿瘤重量、MCL-1 mRNA和蛋白表达降低,miR-340-5p表达升高(均P<0.05)。

表5 PTS干预后对裸鼠肿瘤生长及miR-340-5p/MCL-1轴的影响

3 讨 论

PTS是白藜芦醇的二甲基衍生物,是一种具有潜在化学预防活性的植物多酚化合物。PTS已被证明在多种癌症如前列腺癌[15]、胃癌[16]等中具有抗癌的作用。研究[17]表明,PTS能促进肿瘤细胞凋亡,导致S期阻滞,抑制细胞增殖、迁移和过度侵袭。此外,PTS可通过增强自然杀伤细胞活性,从而杀死前列腺癌细胞[18]。PTS在GBC中的抗癌作用已有报道[9],其潜在的机制还需进一步探索。在本研究中,我们分析了PTS对体外GBC细胞的影响,结果显示,与对照组比较,PTS组细胞存活率、集落形成数、迁移率、细胞侵袭数、Ki67、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达降低,细胞凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达升高,与HOJO等[16]和WAWSZCZYK等[17]研究结果一致,表明PTS可抑制GBC-SD细胞增殖、迁移、侵袭并促进GBC-SD细胞凋亡,提示PTS能抑制GBC-SD细胞的恶性生物学行为,进而减弱其恶性进展。

miRNA是基因表达的重要转录调控因子,在癌症中发挥重要功能[19-20]。miR-340-5p作为一种miRNA,在多种肿瘤中下调并可作为肿瘤抑制基因[21]。在结直肠癌组织和细胞系中,miR-340-5p表达明显下调,过表达miR-340-5p可提高结直肠癌患者总生存期,并抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭[22]。在GBC中,下调miR-340-5p使得GBC患者的存活率降低,促进GBC细胞生长[11]。本研究结果显示,与PTS组比较,PTS+miR-340-5p沉默组细胞存活率、集落形成数、迁移率、细胞侵袭数、Ki67、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达升高,细胞凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达降低,表明在PTS干预的基础上沉默miR-340-5p可使PTS对GBC-SD细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力及增殖凋亡相关蛋白表达的作用效果减弱,PTS可能通过上调miR-340-5p表达影响GBC-SD细胞生物学行为。

MCL-1是肿瘤中高表达的抗凋亡蛋白,通过与Bcl-2家族的促凋亡成员Bax和Bcl-2相关K蛋白结合,阻断线粒体外膜通透性、细胞色素C释放和Caspase级联激活,从而保护细胞免于凋亡。在癌症细胞中,MCL-1过表达有助于致癌[23]。HSIEH等[24]研究显示,下调MCL-1表达有利于促进人前列腺癌细胞凋亡,抑制前列腺癌生长。在乳腺癌中,高表达MCL-1与预后不良有关,抑制MCL-1表达能抑制乳腺癌移植瘤在体内的生长[25]。本研究发现,PTS干预后可升高GBC-SD细胞中miR-340-5p表达,降低MCL-1 mRNA和蛋白表达;与PTS单独干预GBC-SD细胞比较,PTS和沉默miR-340-5p联合干预会降低GBC-SD细胞中miR-340-5p表达,升高MCL-1 mRNA和蛋白表达;且miR-340-5p和MCL-1存在靶向调控关系,MCL-1是miR-340-5p的下游靶点。这些都说明PTS可通过上调miR-340-5p表达进而抑制MCL-1表达。体内裸鼠移植瘤实验显示,PTS能抑制裸鼠肿瘤生长和MCL-1 mRNA和蛋白表达,促进miR-340-5p表达。以上结果表明,PTS能通过促进miR-340-5p表达进而抑制MCL-1表达,抑制GBC-SD细胞增殖、迁移和侵袭,促进GBC-SD细胞凋亡。

综上所述,PTS可通过上调miR-340-5p表达下调MCL-1表达,抑制GBC-SD细胞增殖、迁移和侵袭,促进GBC-SD细胞凋亡。本研究为GBC的新药研发和靶向治疗提供了理论前景。本研究不足之处在于涉及影响GBC细胞的生物学行为的基因较多,PTS是否可通过其他通路调控GBC恶性进展有待进一步研究。